Réaction vis-à-vis des microcapsules

L’observation microscopique de la moelle épinière colorée à l’Hémalun et à l’Orange G (3 semaines et un mois après implantation) n’a pas mis en évidence de réaction inflammatoire vis-à-vis des microcapsules. On n’observe pas à ce stade la présence d’infiltrat lymphocytaire (figure 36A et B).

Bien que ces résultats préliminaires montrent l’absence de réponse immunitaire vis-à-vis des microcapsules, d’autres investigations sont nécessaires pour confirmer ces résultats.

80 X

A

B

Figure (36) : Observation microscopique de la moelle épinière après coloration à l’Hémalun et à l’Orange G. Nous observons des microcapsules sur les coupes et une absence d’infiltrat

lymphocytaire autour des microcapsules. Les photos ont été prises en microscopie optique (Leitz Dialux 20). (A) capsule contenant des cellules greffée au niveau de la moelle cervicale, (B) capsule vide greffée au niveau de la moelle lombaire.

Viabilité et fonctionnalité des cellules microencapsulées implantées chez le rat Bien que l’on retrouve difficilement les microcapsules sur les coupes histologiques de moelle épinière en raison de leur perte lors de l’implantation et des étapes expérimentales histologiques (déshydrations, réhydrations, réactivation antigénique à micro-onde, rinçage plusieurs fois, ….), les cellules chromaffines retrouvées sur ces coupes sont viables et fonctionnelles trois semaines après leur implantation chez le rat en exprimant la tyrosine hydroxlase (TH) et la met-enképhaline (ME).

60 X

60 X

_Cervelet

Cervelet

CCB

HO

CCB

CAPSULE

IHC

1000 X

1000 X

CCB

ME

HO

TH

1000 X

Figure (37) Mise en évidence in vivo des cellules chromaffines bovines encapsulées. Trois semaines après la greffe, les rats sont sacrifiés et perfusés avec du PFA, les moelles sont disséquées, fixées et

incluses en paraffine. Les moelles lombaires et cervicales sont coupées, colorées à l’Hémalun et à l’Orange G (HO). Des coupes sont faites pour l’étude immuno-histochimique (IHC), les cellules chromaffines bovine (CCB) trouvées sur ces coupes sont fonctionnelles trois semaines après leur implantation chez le rat en montrant un marquage positif mais faible pour la TH et pour la ME.

Les douleurs neuropathiques demeurent un problème majeur de santé publique. Sur le plan clinique, ces douleurs sont résistantes aux analgésiques habituels et représentent un véritable challenge thérapeutique (Kennedy 2007). Ces douleurs, qui surviennent en l’absence de stimulation douloureuse, sont fréquentes (1 % de la population et représentent 30 à 40 % des consultations dans les Centres d’Evaluation et de Traitement de la Douleur "Etude TRIDENT réalisée par Novartis, 2001". Actuellement on estime que même les thérapies les plus sophistiquées apportent un effet analgésique bon ou modéré chez moins de 30 % des patients atteints de douleurs chroniques rebelles d’origine non maligne (Jensen 2005).

Les stratégies actuelles du traitement des douleurs neuropathiques reposent sur des mécanismes découverts récemment. Deux approches essentielles sont en développement : l’approche pharmacologique avec de nouvelles molécules basées sur les mécanismes moléculaires des douleurs neuropathiques (antagoniste du glutamate et agonistes GABA) et la thérapie cellulaire afin de restaurer l’ensemble des fonctions nerveuses.

Deux approches différentes ont été réalisées dans la thérapie cellulaire des douleurs chroniques (Czech et Sagen 1995). La première consiste à transplanter dans l’espace intra-thécal des morceaux de tissu médullo-surrénalien allogénique. Celle-ci a donné des résultats prometteurs dans plusieurs essais cliniques et a été proposée comme une alternative au traitement des douleurs cancéreuses rebelles (Winnie et al. 1993 ; Lazorthes et al. 2000a). De plus, cette technique a permis de vérifier la faisabilité, l’innocuité et l’efficacité potentielle du concept mais elle reste inutilisable en clinique humaine du fait du faible nombre de dons d’organes et de la lourdeur de préparation du greffon (Czech et Sagen 1995 ; Lazorthes et al. 2000b).

La deuxième approche est l’utilisation de sources cellulaires alternatives telles que les cellules chromaffines xénogéniques provenant de bétail consommable. Celle-ci pourrait permettre une extension de la technique en évitant les problèmes d’approvisionnement tissulaire rencontré dans l’allogreffe. Plusieurs travaux ont montré que les cellules chromaffines bovines pouvaient être utilisées dans la thérapie cellulaire des douleurs chroniques. Elles présentent l’avantage de pouvoir être isolées en grande quantité, avec une bonne viabilité et surtout de pouvoir être purifiées afin d’obtenir des suspensions contenant entre 70 à 95 % de cellules chromaffines. De plus, les xénogreffes de cellules chromaffines se comportent comme des systèmes implantables, en libérant de manière continue dans le SNC des substances aux propriétés analgésiques telles que les catécholamines et les enképhalines (Wilson et al. 1982).

Malgré le privilège immunologique du système nerveux central, il semble que les transplants xénogéniques dégénèrent rapidement si un traitement immunosuppresseur n’est pas mis en route, au moins à court terme (Ortega et al. 1992). Or, les effets indésirables, notamment digestifs, et la toxicité à long terme de la ciclosporine A suscitent de sérieuses réserves vis-à-vis d’une telle stratégie thérapeutique immunosuppressive.

La technique d’immuno-isolement pourrait être une alternative pour implanter les cellules vivantes dans le système nerveux central. Il s’agit de la bio-encapsulation. Les capsules protègent les cellules encapsulées par l’édification à leur périphérie d’une membrane permi-sélective qui permet une diffusion dans les deux sens de substances de faible poids moléculaire telles que les sécrétions cellulaires bio-actives, les nutriments, les électrolytes, l’oxygène et les facteurs neurotrophiques de l’hôte. De plus, elle joue le rôle de barrière vis-à- vis des molécules de gros poids moléculaire telles que les immunoglobulines et/ou des facteurs du complément (Lim et Sun 1980 ; Aebischer et al. 1988).

Mais la mise en œuvre de cette membrane ne doit pas nuire à la viabilité et à la fonctionnalité des cellules encapsulées. Les matériaux constitutifs de la membrane doivent donc être biocompatibles, à la fois pour les cellules à encapsuler et pour l’hôte (De Vos et al. 1993 ; Li 1998). Enfin, la structure ainsi conçue doit être suffisamment stable pour conserver ses propriétés physicochimiques et pour obtenir un effet thérapeutique efficace (Li 1998 ; Uludag et al. 2000).

Les premières études pré-cliniques et cliniques concernant l’utilisation des cellules chromaffines encapsulées dans le traitement des douleurs chroniques ont été réalisées en implantant des macrosystèmes (Aebischer et al. 1994 ; Joseph et al. 1994 ; Buchser et al. 1996 ; Linder et al. 2000 ; Winn et Emerich 2005). D’autres ont été effectuées en implantant des microcapsules (Kim et al 2004; Jeon et al. 2006). Au niveau du choix macroencapsulation versus microencapsulation, les avis sont très controversés : certains auteurs préfèrent un seul implant qui grâce à sa taille peut contenir un grand nombre de cellules (Joseph et al. 1994 ; Date et al. 2000 ; Broadhead et al. 2002) ; d’autres préfèrent les microcapsules qui permettent une meilleure diffusion au travers la membrane et une meilleure viabilité cellulaire accompagnée d’une facilité d’implantation grâce à leur petit diamètre (Uludag et al. 2000 ; Kim et al 2004 ; Jeon et al. 2006).

En fait, les encapsulations cellulaires sont assez récentes dans le traitement de la douleur, il existe très peu d’études disponibles concernant les cellules chromaffines microencapsulées dans ce domaine.

Dans notre laboratoire, nous avons développé une technique d’encapsulation des cellules chromaffines dans des microcapsules d’alginate-PLL-alginate (APA). Ce système est considéré comme étant le complexe de choix spécialement pour des applications in vivo (Goosen et al. 1985 ; Stang et al. 1993 ; De vos et al. 2003 ; Yoshioka et al. 2003 ; Bünger et al. 2005), d’autant plus que durant la dernière décennie beaucoup de progrès ont été réalisés dans la connaissance du polymère et de l’influence du procédé de préparation sur les propriétés des microcapsules d’APA résultantes (King et al. 1987 ; Thu et al. 1996 ; De vos et al. 1997). Les techniques d’encapsulation se sont modernisées (Uludag et al. 2000 ; Orive et al. 2003 ; Darrabie et al. 2005 ; Dufrane et al. 2006 ; Jeon et al. 2006), des automates ont été mis au point et sont désormais commercialisés, rendant la préparation des microcapsules plus simple, plus rapide et plus reproductible.

Notre travail a débuté par l’isolement, la culture et la caractérisation de cellules chromaffines bovines. Le nombre de cellules isolées à partir des glandes bovines était estimé à 1-1,5 x 107 / glande. L’isolement de cellules chromaffines dépend avant tout de l’efficacité de la digestion enzymatique de la médullosurrénale. Celle-ci est fonction du temps de digestion, de la concentration en collagénase ainsi que de facteurs humains tels que la technique de dissociation et la technique de perfusion des glandes. Après l’isolement, la viabilité cellulaire a été appréciée par la méthode d’exclusion au trypan bleu en montrant 10 % de cellules mortes. Ces résultats sont en accord avec les résultats déjà obtenus dans notre laboratoire (Sol et al. 2004).

La culture apparaît hétérogène, on note la présence d’autres types cellulaires telles que des cellules fibroblastiques, des cellules endothéliales et des cellules corticales en raison d’une purification incomplète. Cependant, il a été suggéré que la présence des cellules corticales en co-culture avec les cellules chromaffines contribue à améliorer leur viabilité et l’activité des cellules chromaffines en recréant en quelque sorte leur microenvironnement physiologique et en améliorant ainsi la survie des greffes in vivo (Sagen et al. 1991 ; Vizzardelli et al. 2001). L’étude immuno-cytochimique montre également que les cellules chromaffines bovines sont catécholaminergiques (expriment la TH) et contiennent des substances aux propriétés analgésiques (la met-enképhaline).

Ces résultats sont corrélés avec ceux de la littérature (Livett et al.1981) et déjà obtenus dans notre laboratoire (Sol et al. 2004).

La microencapsulation de cellules chromaffines dans les microcapsules d’alginate/PLL/alginate (APA) a été réalisée selon la technique décrite par Goosen avec quelques modifications (Goosen et al. 1985). L’immobilisation des cellules vivantes dans des microcapsules d’alginate présente l’avantage d’être une technique simple et facile (Downing et al. 1980 ; Uludag et al. 2000).

L’alginate choisi est sous forme de sel de sodium et présente une viscosité égale à 2960 cps à 25°C en solution aqueuse à 2%. Cette caractéristique permet d’envisager le passage dans un encapsulateur équipé de buses allant de 800 µm à 200 µm, et d’obtenir des microsphères bien formées et résistantes en présence de chlorure de calcium. L’alginate choisi présente un rapport M/G de 0.96, car les alginates riches en acide mannuronique (M) interagissent rapidement et facilement avec les polycations en donnant des capsules ayant des membranes plus stables (De Vos et al. 1997). De plus, les microcapsules formées avec ce type d’alginate sont biocompatibles in vivo (Duvivier-Kali et al. 2001).

La technique de préchargement utilisée présente des avantages comparativement à celle de post-chargement (moindre risque de contamination, fort taux d’encapsulation de 3 millions cellules/ml d’alginate). Les cellules sont mélangées avec une solution d’alginate de sodium à 1,5 % p/v. Dans le cas d’encapsulation de cellules vivantes, la mise en solution de l’alginate de sodium est réalisée dans une solution de tampon 1. Le pH joue bien évidemment un rôle fondamental dans l’encapsulation cellulaire, les cellules vivantes étant très sensibles à ses variations. Des conditions très acides ou très basiques entraînent une mortalité cellulaire importante (Livett 1984). Afin d’améliorer la viabilité cellulaire, nous avons tamponné toutes les solution à pH 7,4. La gélification d’alginate de sodium a été effectuée avec 68 mM de chlorure de calcium. La membrane a été formée par incubation avec 0.1% de Poly-L-lysine (PM de 30,2 kDa) pendant 15 min. Il en résulte une membrane rigide, permanente et stable. Les billes ont subi ensuite un traitement par une solution de citrate à 55 mM pendant 10 min pour liquéfier le cœur interne. Au regard de la littérature, cela permet aux cellules encapsulées une meilleure croissance (Lim et Sun 1980 ; Lim et Moss 1981 ; Goosen et al. 1985).

Enfin les microcapsules ont été incubées avec une solution diluée d’alginate pour neutraliser les charges positives de la PLL non associées qui représentent un facteur principal de la bioincomptabilité des microcapsules produites (Strand et al. 2001 ; De Vos et al. 2002).

Tous ces paramètres fixent les conditions et les étapes de fabrication susceptibles d’influencer la stabilité, la perméabilité des microcapsules et par la même le devenir in vivo de ces microcapsules.

Une modification apparemment mineure du procédé d’encapsulation peut avoir une influence directe sur les caractéristiques physicochimiques des microcapsules et par conséquence sur la réponse de l’hôte contre ces capsules et ainsi, sur leur devenir des microcapsules (Uludag et al. 2000).

De fait, les paramètres mentionnés ci-dessus sont rarement documentés même dans des études récentes (Kim et al. 2004 ; Jeon et al 2006). Dans ce contexte, nous avons validé la faisabilité de l’encapsulation des cellules chromaffines dans des microcapsules APA par une étude physicochimiques des caractéristiques des microcapsules et par une étude in

vitro et in vivo de la viabilité et la fonctionnalité des cellules chromaffines microencapsulées.

Le diamètre moyen des microcapsules obtenues avec une seringue de 50 ml équipée d’une aiguille de 0.6 mm est d’environ 1,2 mm et celui des microcapsules obtenues avec un microencapsulateur équipée d’une buse de 300 µm est à l’ordre de 600 µm.

Les microcapsules sont stables dans le milieu de culture et dans le tampon 1 au cours du temps, en effet aucune dégradation ni modification structurale n’a été observée. Notre procédé de préparation a produit des microcapsules non agglomérées et majoritairement sphériques. Après avoir séché des microcapsules intègres, l’observation en microscopie électronique à balayage nous a permis de visualiser leur membrane. Cette observation microscopique montre que les microcapsules sont creuses, formées par une membrane complexe d'APA entourant un cœur liquéfié.

L’étude de la perméabilité s’avère essentielle dans la connaissance des paramètres de bio encapsulation (Li 1998 ; Colton et al. 1991 ; Uludag et al. 2000). Les caractéristiques physicochimiques des microcapsules et leur perméabilité modifient le transfert de différentes substances de poids moléculaire et de structure variables de part et d’autre des microcapsules. Ces mêmes paramètres peuvent conditionner le cinétique de diffusion des neuromédiateurs a visée analgésique. Nous avons utilisé des molécules présentant des poids moléculaires différents : vitamine B12 (PM 1355 Da), α-lactalbumine (PM 14,2 kDa) et BSA (PM 67 kDa). Au cours de l’étude, seules la vitamine B12 et l’alpha lactalbumine diffusent librement par la membrane. L’alpha lactalbumine diffuse plus lentement en raison de son poids moléculaire plus élevé. Dans ce cas, le nutriments, comme le glucose (PM de 186 Da), l’oxygène, les facteurs neurotrophiques devraient pouvoir diffuser librement à travers la membrane, garantissant une bonne survie cellulaire. Parallèlement, les produits de sécrétion des cellules chromaffines tels que l’adrénaline (PM 183,2 Da), la noradrénaline (PM 169,2 Da), la dopamine (PM 189,6 Da) et la met-enképhaline (PM 573 Da) devraient pouvoir diffuser dans le milieu extérieur en provoquant un effet thérapeutique.

Par contre, la membrane a totalement empêché la diffusion de la BSA, ceci montre que la membrane représente une barrière vis-à-vis des molécules de gros poids moléculaire égal ou supérieur à celui de la BSA telles que les immunoglobulines (PM 150 kDa) et les facteurs du complément (PM 220 kDa).

Les résultats montrent que les microcapsules présentent une membrane semi- perméable ayant un seuil de coupure supérieur à 14,2 kDa et inférieur à 67 kDa, ce qui protège les cellules contre le système immunitaire de l’hôte.

Les microcapsules conservées dans le milieu de culture et dans le tampon de fabrication (tampon1: HEPES + NaCl pH 7.4) restent résistantes à la compression au cours du temps, les microcapsules conservées dans le milieu de culture présentant une résistance supérieure mais non significative à celles conservées dans le tampon de fabrication. Ceci pourrait s’expliquer par la force ionique et par la composition plus complexe du milieu de culture. Dans le cas des microcapsules APA de petite taille, le test de passage via le manchon d’un cathéter 20G montre que les microcapsules résistent à une injection. 56,7 % ± 3,8 % et 60 % ± 6,2 % (respectivement microcapsules vides et microcapsules chargées en cellules) d’entre elles sont non déformées après injection, ce qui est d’un bon pronostic pour une implantation ultérieure.

Ce résultant est très important dans les applications pré-cliniques car lors de l’implantation des cellules microencapsulées, les microcapsules devront subir de contraintes mécaniques importantes.

L’ensemble de ces résultats montre que la technique et les paramètres utilisés ont permis d’obtenir des microcapsules sphériques, stables au cours du temps et résistantes. Leur membrane permi-sélective pourrait protéger les cellules encapsulées contre le système immunitaire de l’hôte. Ces caractères physico-chimiques répondent aux critères requis dans le cadre d’encapsulation cellulaire. Cependant, les paramètres que nous avons utilisés sont rarement documentés même dans les études les plus récentes (Kim et al. 2004 ; Jeon et al 2006). Nous ne pouvons donc pas comparer nos résultats avec ceux présentés dans la littérature.

L’étude in vitro sur les cellules encapsulées et adhérentes en culture évaluant la viabilité cellulaire montre qu’au delà de J30, les cellules adhérentes ne sont plus viables. Par contre, la viabilité des cellules chromaffines encapsulées dans les microcapsules d’APA est maintenue au cours du temps et ce jusqu’à la fin de l’étude, soit respectivement 44 jours post encapsulation pour les cellules encapsulées dans des microcapsules de grosse taille et 35 jours pour celles encapsulées dans des microcapsules de petite taille. Dans les deux cas, quelques cellules mortes sont observées dès le début en périphérie des microcapsules.

Il semblerait qu’elles correspondent à des cellules emprisonnées dans le complexe d’APA lors de l'étape de formation de la membrane.

Ces résultats permettent de conclure que la viabilité des cellules chromaffines bovines n’est pas compromise par l’encapsulation. De plus, ils montrent le besoin, pour ces cellules d'une matrice ou d’un support pour maintenir leur survie. En effet, plusieurs auteurs ont montré que l'addition d'une matrice ou l’ajout d’un polymère tel que l'alginate ou le collagène lors du procédé de bio-encapsulation fournit aux cellules dépendantes d’un support, le substrat nécessaire pour leur adhérence et leur viabilité (Zielinski et Aebischer 1994 ; Date et al. 1997 ; Decosterd et al. 1998).

Les matrices internes le plus souvent utilisées dans le cadre d’encapsulation cellulaire sont des hydrogels à base d’alginate, de collagène, de chitosane, d’agarose, de PVA ou d’acide poly lactique glycolique «PLGA» (Saporta et al. 1997 ; Borolongan et al. 1998 ; Elcin et al. 1998 ; Elcin et al. 2003). Duplan et ses collègues ont rapporté une relation directe et significative entre l’adhérence des tissus médullaires chromaffines durant leur culture et leur niveau de sécrétion de catécholamines (Duplan et al. 2000). Il a été montré par d’autres auteurs que l’adhérence des cellules chromaffines aux parois des capsules améliore leur survie et leur fonctionnalité. Leur immobilisation dans une matrice interne stimulerait ces cellules pour sécréter leur propre matrice extracellulaire et améliorerait, de ce fait, leur survie et leurs fonctions sécrétoires (Cherskey et al. 1996 ; Borlongan et al. 1998; Sagen et al.1999).

La fonctionnalité des cellules chromaffines a été mise en évidence par l’expression de la TH en Western Blot. Au cours de l’étude, les cellules encapsulées dans les microcapsules de grosse taille montrent une forte expression de la TH qui reste stable et semblable à celle des cellules adhérentes. Dans le cas de cellules encapsulées dans les microcapsules de petite taille, on observe aussi une expression de la TH au cours de l’étude. On peut noter une diminution de cette expression à J35 vraisemblablement en raison de la diminution de la viabilité cellulaire et/ou la fonctionnalité cellulaire.

Ces observations permettent de conclure que les cellules chromaffines microencapsulées sont capables de synthétiser et d’exprimer la TH de façon similaire à celle des cellules adhérentes. Ces résultats sont en accord avec les résultats déjà réalisés dans notre équipe concernant la capacité des cellules chromaffines bovines à exprimer la TH in vitro (Sol et al. 2004).

La fonctionnalité des cellules chromaffines microencapsulées a été affirmée par la mise en évidence des marqueurs caractéristiques des cellules chromaffines.

Les cellules chromaffines bovines encapsulées dans les microcapsules de grosse taille sont viables et fonctionnelles 37 jours post-encapsulation et mise en culture, ceci en exprimant spécifiquement la TH.

Egalement les cellules encapsulées dans les microcapsules de petite taille, qui sont encore viables sont fonctionnelles 35 jours post-encapsulation en exprimant la TH, la DβH et la met-enképhaline (ME). Ces résultats sont en accord avec les résultats déjà montrés dans la littérature et par notre équipe concernant la caractérisation des cellules chromaffines en culture (Duplan et al. 200 ; Sol et al. 2004).

La fonctionnalité des cellules microencapsulées et a été réalisée par une étude cinétique de la sécrétion des catécholamines. En comparant la sécrétion des catécholamines des cellules encapsulées (microcapsules de grosse taille) à celle des cellules adhérentes, seules les cellules encapsulées sont capables de garder leur capacité à sécréter les catécholamines après J30 et jusqu’à J44. Il semblerait que les capsules favorisent la survie cellulaire. Le profil de sécrétion des cellules encapsulées est le même que celui des cellules adhérentes, on n’observe pas de différence statistique significative [sauf à J4 (p<0.01)]. Il a été démontré que l'environnement des cellules peut modifier leur capacité sécrétoire, ceci d'une manière imprévisible (Sagen et Ortega 1994; Uludag et al. 2000).

Ces résultats sont en accord avec ceux de la littérature montrant la capacité des