Etude in vivo

Une étude préliminaire de greffe de cellules chromaffines microencapsulées fabriquées à l’aide de l’encapsulateur et de microcapsules vides (diamètre de microcapsules compris entre 500 et 710 µm) a été effectuée sur 8 rats.

5.1- Animaux

Toutes les études ont été réalisées sur des rats mâles adultes albinos de la lignée Sprague-Dawley, provenant du centre d’élevage Janvier (France), pesant entre 225 et 250 grammes à leur arrivée. Les animaux sont placés dans des cages par groupe de 2 à 3, une semaine avant le début de l’expérience. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. Au sein de l’animalerie, une température thermostatée entre18 et 22°C est maintenue. Les recommandations du comité d’éthique de l’Association Internationale pour l’Etude de la douleur (IASP) ont été respectées au cours des expériences (Zimmermann 1983).

Pour les études in vivo les animaux sont divisés en 4 groupes :

I- Rats greffés dans l’espace I-Th lombaire avec des cellules chromaffines microencapsulées (n=2). II- Rats greffés dans l’espace I-Th cervical avec des cellules chromaffines microencapsulées (n=2). III- Rats greffés dans l’espace I-Th lombaire (n=1) et cervical (n=1) avec des microcapsules vides IV- SHAMS : Rats opérés aux niveaux lombaire et cervicale sans injection de microcapsules (n=2).

- La moitié de rats sera sacrifiée 21 jours post-implantation (Groupe A) - L’autre moitié sera sacrifiée 30 jours post-implantation (Groupe B)

5.2- Greffe des cellules Chromaffines microencapsulées et des microcapsules vides Les procédures chirurgicales d’implantation intra-thécale ont été effectuées en condition d’asepsie stricte sur des animaux anesthésiés par injection intrapéritonéale du Thiopental 50 mg/kg.

5.2.1- Greffe au niveau lombaire

Les implantations intra-thécale de microcapsules sont effectuées via une laminectomie lombaire réalisée selon la technique décrite initialement par Sagen (Sagen et al. 1986b). Après anesthésie, les rats sont rasés au niveau de la région lombaire.

Après une préparation cutanée classique avec de la Bétadine dermique, la peau est incisée sur 3 cm au scalpel. Les insertions musculaires para-vertébrales sont incisées et détachées le long de l’axe vertébral de façon bilatérale afin de dégager les processus épineux et articulaires des vertèbres lombaires sur les trois étages L1, L2 et L3. Les processus épineux des trois vertèbres sont alors coupés aux ciseaux courbes. Les étapes suivantes sont réalisées sous microscope. La partie corticale lamaire est enlevée dans un premier temps à la fraise carbone jusqu’à atteindre le ligament jaune puis la fraise diamantée est utilisée à l’approche de la dure mère.

Les derniers fragments osseux retirés, la dure-mère et la membrane arachnoïdienne sont ouverts sur 2 à 3 mm à l’aide d’une fine aiguille 22G. Les microcapsules remplies de cellules chromaffines et les microcapsules vides d’un diamètre compris entre 500 et 710 µm sont implantées selon les procédures suivantes :

Entre 20 et 30 microcapsules sont mises dans le corps de manchons d’un cathéter 20G, puis une seringue de 1 ml contenant 0.5 ml de chlorure de sodium stérile à 0.9 % y est abouchée. Le manchon est au préalable biseauté puis enfoncé au travers de la dure mère et de l’arachnoïde, puis glissé sur 2 cm dans l’espace sous-arachnoïdien vers la partie rostrale. Les capsules sont alors lentement injectées via le manchon dans l’espace intra-thécal autour de la moelle épinière lombaire. Après injection complète le cathéter est laissé en place quelques minutes afin d’éviter un reflux au travers de l’ouverture durale, puis il est retiré lentement. Le tissu musculaire est refermé au fil résorbable 4/0 et la peau est refermée au fil non résorbable. Les rats sont placés en salle de réveil.

5.2.2- Greffe au niveau cervical

Les microcapsules ont été implantées chirurgicalement au niveau de la grande cisterne cérébelleuse sur trois rats anesthésiés par voie intrapéritonéale par du Thiopental 50 mg/kg (Abott). Après désinfection à la Bétadine dermique à 10 %, on réalise une incision cutanée de 3 cm centrée sur la région cervico-occipitale. Les muscles sont progressivement écartés pour dégager la membrane occipito-atloidïenne. Celle-ci est ensuite ouverte sur 3 mm à l’aide d’une aiguille 22G et 20-30 microcapsules sont transférées dans la cisterne au contact de la partie postérieure du tronc cérébral par la technique décrite précédemment. Enfin les muscles et la peau sont suturés.

5.3- Perfusion intra-cardiaque et fixation des animaux

Trois et quatre semaines après implantation (respectivement Groupe A et B), les rats sont anesthésiés par injection intra péritonéale (Thiopental 50 mg/kg). Une sterno- laparotomie médiane a été réalisée pour permettre la perfusion intra-cardiaque (canulation du ventricule gauche et ouverture simultanée de l’oreillette droite). Les tissus sont d’abord lavés avec 300 ml de chlorure de sodium (0.9%) dans du tampon phosphate 0,1 M contenant de l’héparine (5000 U.I/L) puis fixés avec 500 ml de solution de paraformaldéhyde à 4% dans du tampon phosphate 0.1 M pH 7,2.

5.4- Prélèvement de la moelle épinière

Sous hotte chimique, le rat est placé en position ventrale sur du papier absorbant, puis la peau est incisée et l’axe vertébral dégagé sur toute sa longueur cervico-dorso-lombaire.

Une laminectomie réalisée à l’aide d’une pince gouge permet d’extraire l’axe médullaire sans lésion tissulaire. A l’aide d’un scalpel, la moelle a été nettoyée des nerfs rachidiens puis incubée dans des fioles contenant du formol à 4%.

Anesthésie

Matériel chirurgical Cathéter

Perfusion intra-cardiaque Prélèvement de la moelle La moelle

Figure (15) : Etapes chirurgicales lors de l’implantation des microcapsules et lors du prélèvement de la moelle épinière pour la localisation histologique des microcapsules.

5.5- Préparation des coupes histologiques

La préparation des coupes histologiques a été réalisée selon le même protocole déjà décrit lors de l’étude immuno-histochimique des cellules encapsulées en culture (cf. voir protocole immuno-histochimie des cellules microencapsulées en culture). Les lames sont ensuite colorées à l’Hémalun et à l’Orange G, puis elles sont montées avec l’Eukitt. Quand les capsules sont repérées sur une lame colorée et numérotée, sur ce même ruban, deux coupes avant et deux coupes après à 5 µm sont prélevées sur des lames gold plus pour l’étude immunohistochimique.

5.6- Etude immuno-histochimique sur la viabilité des cellules microencapsulées implantées chez le rat

L’immuno-marquage s’effectue selon le protocole déjà décrit en utilisant les anticorps primaires anti-TH 1/5000ème (souris) ou anti-met-enképhaline 1/500ème (lapin) (cf. voir protocole immuno-histochimie des cellules microencapsulées en culture).

Les cellules chromaffines bovines (CCB) ont été utilisées dans ce travail en raison de la facilité d’isolement des ces cellules à partir des glandes surrénales bovines. De plus, elles présentent l’avantage de pouvoir être isolées en grande quantité, avec une bonne viabilité, la culture de ce type cellulaire était bien maîtrisée dans notre équipe.