Microencapsulation de cellules chromaffines bovines dans le traitement des douleurs chroniques rebelles : étude de faisabilité in vitro et in vivo

Texte intégral

(1)Année Universitaire 2007-2008. UNIVERSITE TOULOUSE III- PAUL SABATIER THESE En vue de l’obtention du. DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE Délivré par l’Université Toulouse III- Paul Sabatier Discipline: Pharmacie Clinique Présentée et soutenue Par Tarek Mohamed Mohamed MOUSTAFA Le 23 Octobre 2007. Microencapsulation de cellules chromaffines bovines dans le traitement des douleurs chroniques rebelles : Etude de faisabilité in vitro et in vivo DIRECTEUR DE THESE: Pr. Brigitte SALLERIN (Professeur de pharmacie clinique). Co-DIRECTUR DE THESE: Dr. Sophie GIROD-FULLANA JURY Monsieur le Professeur Yves LAZORTHES. Président. Monsieur le Professeur Hatem FESSI. Rapporteur. Madame le Professeur Marie-Claude SAUX. Rapporteur. Madame le Professeur Brigitte SALLERIN. Directeur de thèse. Laboratoire de Thérapie Cellulaire et Génique des Douleurs Chroniques (EA 3039) Faculté de Médecine Toulouse Rangueil 133 route de Narbonne-31062 Toulouse Cedex. i.

(2) Je dédie ce travail, A l’esprit de ma mère. A ma femme qui m’a beaucoup soutenu toutes ses années. A mes enfants Omar, Samya et Mohamed. A mon père, mes frères et mes sœurs. A tous mes amis égyptiens et français. A tout le monde dans le laboratoire de thérapie cellulaire, d’histologie et de pharmacie galénique. Un grand merci pour votre aide précieuse, votre gentillesse et votre patience sans limite, ce travail est le vôtre….. ii.

(3) REMERCIEMENTS A la fin de ce travail, je tiens à exprimer ma plus profonde reconnaissance à: Monsieur le Professeur YEVES. LAZORTHES, vous m’avez fait l’immense honneur de m’accepter en doctorat d’université dans votre laboratoire il y a quatre ans. Je vous remercie pour votre soutien et vos précieux conseils qui m’ont apporté motivation et encouragement durant la préparation de cette thèse. Monsieur, veuillez trouver dans ce travail l’expression de ma plus profonde reconnaissance et de mon plus profond respect. Madame le Professeur Brigitte SALLERIN qui a dirigé et suivi ces travaux de recherche. Je vous remercie pour votre aide précieuse, votre gentillesse, votre patience et votre soutien durant ces nombreuses années. Je vous remercie d’avoir accepté de diriger ce travail, soyez assurée de tout mon respect et ma reconnaissance. Madame le Docteur Sophie GIROD FULLANA qui a également dirigé et suivi ces travaux. Je vous remercie chaleureusement de tout l’aide que vous avez apporté et de m’avoir permis d’acquérir de nombreuses connaissances scientifiques dans le domaine de la pharmacie galénique. Veuillez trouver ici le témoignage de ma gratitude. Monsieur le Professeur F. RODRIGUEZ, vous m’avez accueilli au sein de votre laboratoire à plusieurs reprises et je vous remercie sincèrement. Durant ce travail j’ai pu apprécier votre gentillesse, votre humanité et vos conseils avisés. Veuillez trouver ici l’assurance de ma respectueuse admiration. Je remercie également le Professeur H. FESSI et le Professeur MC SAUX pour leur gentillesse et pour m’avoir fait l’honneur d’évaluer ce travail en qualité de rapporteurs. Je vous exprime ma plus haute considération. Je tiens à exprimer mes remerciements à Mme le Docteur S. JOZAN, à Mme le Docteur L. WEISS, à Mme le docteur S. CHATELIN, à Mme le Docteur R. LI et à Monsieur le Docteur JC. SOL pour leur aide et leur soutien constant et amical tout au long de ces années. Toute ma profonde gratitude à Mme F. TORTOSA qui n’a cessé de m’aider et me soutenir pendant ma recherche. Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Monsieur le Professeur J. JOACHIM qui n’a pas cessé à m’aider pendant mon séjour en France. Bien sûr, sont associés à ces remerciements tous les autres membres du laboratoire de thérapie cellulaire, d’histologie et de pharmacie galénique, notamment, mon cher ami Robert, Viviane, Brigitte, Renan, , Sandrine et Sabine qui n’ont cessé de m’encourager et me soutenir pendant mon séjour en France. J’exprime également ma profonde gratitude à Monsieur B. PAYRE et ma profonde reconnaissance aux membres de l’abattoir à Montauban qui nous ont fourni les glandes surrénales. Merci enfin à mes amis, notamment Dr. Talal ELSAATY, Dr. Hany GAMAL, Dr. Mohamed GADELRAB, Dr. Hisham KOTB, Nour-ELDIN, M et Mme EL-ARABY et aux Commissions d’Education et de Financement d’Egypte qui, ont financé mes études en France, ainsi qu’au bureau culturel de l’ambassade égyptienne à Paris.. iii.

(4) SOMMAIRE. 1.

(5) SOMMAIRE. p1. RESUME. p4. INTRODUCTION. p6. RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE. p9. 1 -La glande surrénale. p 10. 1.1- Rappel anatomique et histologique 1.2- les messagers biologiques 1.3- les produits sécrétés et les mécanismes de sécrétion 2- Stratégie de greffe des cellules chromaffines. p 16. 3-Le concept d’immuno-isolement et le biomatériau. p 19. 4- Macroencapsulation versus microencapsulation. p 21. 5- Alginate et encapsulation. p 25. MATÉRIEL ET METHODES. p 30. 1- Culture et caractérisation des cellules chromaffines bovines in vitro. p 31. 1.1- Isolement et purification des cellules chromaffines bovines. p 31. 1.2- Immuno-cytochimie. p 34. 2- Microencapsulation des cellules chromaffines bovines. p 35. -Principe de formation des microcapsules. p 35. -Microencapsulation en utilisant une seringue équipée d’une aiguille de 600 µm. p 37. -Microencapsulation en utilisant un encapsulateur équipée d’une buse de 300 µm. p 37. 3- Etude physicochimique des microcapsules. p 39. A- Observation en microscopie optique. p 39. B- Observation en microscopie électronique à balayage. p 39. C- Estimation de la répartition granulométrique des microcapsules. p 39. D- Test de résistance mécanique des microcapsules p 39 *Texturométrie (Capsules fabriquées à l’aide d’une seringue et une aiguille de 600 µm) *Passage des capsules via cathéter et manchons de différentes tailles (Capsules fabriquées à l’aide d’un encapsulateur et une buse de 300 µm) E- Etude de la perméabilité membranaire (Spectroscopie UV/Visible) 4- Etude in vitro des cellules encapsulées et adhérentes. p 41 p 42. A- Observation de la viabilité cellulaire en microscopie confocale. p 42. B- Western Blot. p 42. C- Immuno-histochimie. p 43. D- Dosage des catécholamines par HPLC. p 44. 5- Etude in vivo. p 45. 5.1- Animaux. p 45. 5.2- Greffe des cellules microencapsulées et des microcapsules vides. p 45. 5.2.1-Greffe au niveau lombaire 5.2.2-Greffe au niveau cervical 5.3- Perfusion intra-cardiaque et fixation des animaux. p 46. 5.4- Prélèvement de la moelle épinière. p 46. 5.5- Préparation des coupes histologiques. 2.

(6) 5.6- Etude immunohistochimique:. p 47. Observation de la viabilité des cellules microencapsulées implantées chez le rat RESULTATS. p 47 p 48. 1- Caractérisation des cellules chromaffines bovines in vitro. p 49. 1.1- Aspect morphologique des cellules chromaffines bovines en culture. p 49. 1.2- Mise en évidence de la tyrosine hydroxlase (TH) et de la met-enképhaline. p 50. 2-Faisabilité de l’encapsulation des cellules chromaffines bovines dans des capsules APA 2.1- Caractéristiques physicochimiques des microcapsules. p 51 p 51. A- Observations microscopiques. p 51. B- Stabilité et résistance mécanique. p 52. C- Perméabilité membranaire. p 53. 2.2-Viabilité et fonctionnalité des cellules encapsulées in vitro. p 55. A- Viabilité cellulaire. p 55. B- Immuno-détection de la tyrosine hydroxlase (TH). p 57. C- Mise en évidence de la tyrosine hydroxlase. p 58. D- Sécrétion des catécholamines. p 59. 3- Faisabilité de l’implantation intra-thécale de cellules chromaffines bovine encapsulées dans des microcapsules de petite taille. p 61. 3.1- Caractéristiques physicochimiques des microcapsules. p 61. A- Aspect morphologique. p 61. B- Répartition granulométrique des microcapsules. p 62. C- Résistance mécanique. p 63. 3.2-Viabilité et fonctionnalité des cellules encapsulées in vitro. p 66. A- Viabilité cellulaire. p 66. B- Immuno-détection de la tyrosine hydroxlase (TH). p 67. C- Mise en évidence des marqueurs de cellules chromaffines. p 68. 3.3- Etude in vivo. p 69. A- Observation macroscopique et microscopique. p 69. B- Réactions vis-à-vis des microcapsules. p 69. C- Viabilité et fonctionnalité des cellules microencapsulées implantées. p 71. DISCUSSION. p 72. CONCLUSION ET PERSPECTIVES. p 83. BIBLIOGRAPHIE. p 87. PUBLICATION. p 100. 3.

(7) RESUME. 4.

(8) Malgré les avancées réalisées ces dernières années concernant la connaissance des mécanismes physiopathologiques des douleurs neuropathiques, celles-ci demeurent difficiles à traiter. Ceci souligne l’intérêt potentiel d’une approche biologique telle que la greffe intrathécale (I.Th) des cellules chromaffines médullo-surrénaliennes qui sécrètent des substances aux propriétés analgésiques. Néanmoins, les transplants xénogéniques dégénèrent rapidement dans le système nerveux central (SNC) si un traitement immunosuppresseur de court terme n’est pas mis en route. Dans ce contexte, la technique d’immuno-isolement via l’encapsulation cellulaire a été proposée. Dans ce travail, nous rapportons l’isolement, la purification et l’encapsulation des cellules chromaffines bovines. Après une phase de choix de type d’encapsulation et de mise au point des conditions d’encapsulation de ces cellules dans des microcapsules de type alginate /poly-L-lysine/ alginate (APA), nous avons validé la faisabilité de l’utilisation d’une telle technique et d’une telle formulation pour ce type de cellules. Pour cela nous avons réalisé une étude avec deux tailles différentes de microcapsules (diamètre moyen de 1,2 mm et de 600 µm), ceci afin d’évaluer les caractéristiques physicochimiques des microcapsules : stabilité dans le temps, résistance mécanique et perméabilité membranaire. Nous avons mené une étude in vitro visant à évaluer d’une part la viabilité des cellules chromaffines encapsulées et d’autre part leur fonctionnalité par analyse de l’expression de la tyrosine hydroxlase, de la met-enképhaline et de la dopamine-ß-hydroxlase et par évaluation cinétique des sécrétions de catécholamines. Enfin, une étude in vivo a été effectuée en implantant les cellules encapsulées dans les microcapsules de petite taille pour évaluer la faisabilité de l’implantation, la viabilité des cellules microencapsulées et la réponse immunitaire de l’hôte vis-à-vis de ces microcapsules. Les paramètres de fabrication que nous avons utilisé dans le cadre de l’encapsulation des cellules chromaffines permettent d’obtenir des microcapsules sphériques, stables dans le temps et résistantes aux pressions subies lors de l’implantation in vivo. Elles présentent une membrane semi-perméable qui représente une barrière vis-à-vis du système immunitaire. En parallèle, l’étude in vitro sur les cellules microencapsulées montre que ces cellules gardent leur viabilité et leur fonctionnalité au cours de l’étude en exprimant tous les marqueurs étudiés. Une sécrétion basale et stimulée de catécholamines est également observée. L’étude in vivo effectuée chez le rat montre que les cellules chromaffines microencapsulées maintiennent leur viabilité et leur fonctionnalité trois semaines après leur implantation en exprimant la tyrosine hydroxlase et la met-enképhaline. De plus, cette étude montre également que l’hôte ne développe pas de réaction inflammatoire vis-à-vis des microcapsules. En conclusion la microencapsulation des cellules chromaffines bovine dans des microcapsules formées de système alginate/PLL/alginate (APA) n’altère en rien leur viabilité, leur fonctionnalité et leur intégrité pharmacologique. Ainsi ces cellules microencapsulées pourraient être implantées pour des applications in vivo sans traitement immunosuppresseur. Cette technique semble prometteuse, cependant d’autres investigations seraient encore nécessaires (étude pré-clinique plus large, utilisation d’autre polymère,…..) avant de les utiliser en clinique humaine.. 5.

(9) INTRODUCTION. 6.

(10) Les avancées pharmacologiques réalisées au cours de ces dernières années (formes galéniques à libération prolongée de morphine, nouveaux agonistes opioïdes) ont considérablement amélioré la prise en charge des douleurs chroniques, notamment d’origine cancéreuse. Dans la majorité des cas, ces douleurs répondent bien aux traitements classiques tels que la morphine systémique (Schug et al. 1992). Cependant, les limites actuelles de ce traitement (tolérance, survenue d’effets secondaires indésirables), représentent toujours un challenge face à cette stratégie thérapeutique. Par contre, les douleurs neuropathiques d’origine périphérique et/ou centrale qui sont des syndromes douloureux hétérogènes constituent encore un véritable problème de santé publique par leur fréquence et leurs conséquences médico-sociales. Bien que les douleurs neuropathiques aient bénéficié ces dernières années d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques, elles sont en règle générale réfractaires aux analgésiques habituels. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et les opioїdes sont beaucoup moins efficaces dans le traitement de ces douleurs et doivent être administrés aux doses plus élevées et par des voies plus invasives (intra-thécale) pour montrer une efficacité thérapeutique (Kennedy 2007). L’efficacité de médicaments. spécifiques. (antidépresseurs,. antiépileptiques. de. nouvelle. génération,. antagonistes des récepteurs NMDA…) a été vérifiée par des essais contrôlés notamment dans certaines neuropathies périphériques. Cependant, un bon nombre de ces douleurs ne sont pas soulagées, soit en raison de l’apparition d’effets indésirables qui conduisent à l’arrêt du traitement, soit en raison d’une pharmaco-résistance (Sindrup et Jensen 1999 ; Jensen et Baron 2003). Ceci a conduit notre laboratoire à centrer sa stratégie de recherche vers la prise en charge des douleurs neuropathiques par la thérapie cellulaire avec ses différents aspects. Le concept de thérapie cellulaire dans le traitement de la douleur a été initié et développé par une équipe américaine (Sagen et al.1986a, b). Des études pré-cliniques ont démontré que les greffes médullo-surrénaliennes dans l’espace sous-arachnoïdien (I-Th) de modèles animaux de douleur aigue ou chronique induisaient une analgésie significative (Sagen et al. 1986a, b). Différentes études cliniques préliminaires non contrôlées ont confirmé cet effet analgésique durable en corrélation avec une libération de met-enképhaline et de catécholamines dans le liquide cérébro-spinal (LCS), après allogreffe humaine de patients cancéreux en phase terminale (Sagen et al. 1993 ; Winnie et al. 1993 ; Lazorthes et al. 1995). Ces deux types de substances agissent directement sur les récepteurs opioїdes et αadrénergiques au niveau de la jonction radiculo-médullaire et réduisent de façon indépendante et synergique la transmission du message nociceptif au niveau spinal (Sagen et al. 1991).. 7.

(11) Plusieurs corrélations ont pu être obtenues, notamment entre le niveau de Metenképhaline sécrétée dans le LCS et l’effet analgésique et entre le volume de tissu transplanté (Lazorthes et al. 1995). Notre équipe a également effectué une étude clinique de Phase II (Lazorthes et al. 2000a). Cette étude a concerné 15 patients adultes atteints de cancer à un stade terminal, souffrant de douleurs irréductibles, non contrôlées par la morphine systémique. Les résultats obtenus ont confirmé que cette approche permettait de diminuer la quantité de morphine utilisée et d’augmenter de façon durable l’efficacité analgésique. Mais cette étude a souligné les limites de ce protocole : lourdeur de la préparation du greffon et pénurie de dons d’organes. Afin de s’affranchir des limites liées aux allogreffes, la stratégie de notre laboratoire s’est orientée vers l’utilisation des cellules chromaffines xénogéniques, provenant d’un bétail consommable (bovin ou porc) qui rendrait la technique de transplantation I-Th de cellules chromaffines plus facilement utilisable dans le traitement des douleurs chroniques rebelles (Czech et sagen 1995). Malgré le privilège immunologique du SNC, les transplants xénogéniques dégénèrent rapidement dans le SNC si un traitement immunosuppresseur de courte durée n’est pas mis en place (Ortega et al. 1992). Cependant, les effets indésirables et la toxicité à long terme de la ciclosporine A suscitent de sérieuses réserves vis-à-vis d’une telle stratégie thérapeutique. Le concept d’immuno-isolement, par encapsulation cellulaire, représente une solution alternative au traitement immunosuppressif. En 2004, une collaboration entre le laboratoire de « Thérapie Cellulaire et Douleur » et le laboratoire du GEFSOD EA 2631 nous a permis de développer un projet de microencapsulation de cellules chromaffines bovines (CCB) dans des microcapsules d’alginate/PLL/alginate (APA). Le peu d’études concernant la microencapsulation de cellules chromaffines et son effet sur les cellules encapsulées nous a conduit à fixer les objectifs suivants : - Objectif principal: valider la faisabilité de la technique de microencapsulation de cellules chromaffines bovines dans le cadre de la thérapie cellulaire des douleurs chroniques rebelles. - Objectif secondaire: étudier la viabilité et la fonctionnalité de ces cellules microencapsulées in vitro et in vivo chez le rat, et évaluer le réaction inflammatoire visà-vis des microcapsules implantées. Si nos résultats s’avéraient encourageants, nous pourrions appliquer cette technologie à d’autres types cellulaires en thérapie.. 8.

(12) RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE. 9.

(13) 1 -La Glande Surrénale 1.1- Rappels anatomique et histologique Les glandes surrénales sont des glandes endocrines situées le long de la partie supérieure du bord interne du rein. Au nombre de deux, l’une droite et l’autre gauche, elles ont en commun leur structure et leur situation à l’intérieur de la loge rénale (Bouchet et Cuilleret 1991). Chaque glande est enveloppée d’une fine capsule fibreuse, faite d’un tissu de soutien logé dans une atmosphère graisseuse. Elles pèsent de 4 à 6 g chez l’homme. La surrénale est irriguée par trois groupes d’artères qui forment un plexus dans la capsule de la glande, la médulla est irriguée par de petites artères, et elle est innervée par le nerf splanchnique. Il s’agit de fibres sympathiques préganglionnaires, elles sont généralement cholinergiques (Pocock et Richard 2004).. Figure (1) : Représentation schématique de la glande médullosurrénales. Du point de vue histologique, les glandes surrénales adultes sont composées essentiellement de deux régions: la corticosurrénale périphérique et la médullosurrénale centrale. Chez les mammifères, on observe de la superficie jusqu’au centre de la glande, les couches suivantes : A- Une capsule conjonctive, faite de fibroblastes et de fibres de collagène. B- Le cortex, comprenant trois zones : - la zone glomérulaire, à l’origine de la sécrétion des hormones minéralocorticoïde. - la zone fasciculée, composée de travée de cellules très riches en lipides. -la zone réticulée où les cellules sont organisées en travées autour des capillaires plexiformes.. 10.

(14) C- La médulla, constituée de cordons richement vascularisés au sein desquels on observe deux types de cellules chromaffines : les cellules libérant de l’adrénaline et les cellules libérant de la noradrénaline. L’importance de chaque type cellulaire dans la médullosurrénale dépend de l’espèce et de l’âge de l’animal, la quantité de cellules sécrétant de l’adrénaline augmente avec l’âge. Certaines espèces animales comme le hamster, ne possèdent que des cellules à adrénaline alors que la glande de bœuf contient seulement 20 à 40 % de cellules à noradrénaline. Chez l’homme, les cellules à adrénaline sont plus nombreuses (95 %), les cellules à noradrénaline ne constituent que de petits îlots isolés (Benchimol et Cantin 1977). Il faut noter qu’il existe un troisième type de cellules chromaffines nommé SGC "Small granule chromaffin ou cellules chromaffines à petites granulations" dans la médullosurrénale. Ces cellules ont été observées uniquement chez l’animal, d’abord chez les vertébrés inférieurs (oiseaux, reptiles), puis ultérieurement chez divers mammifères (Tischler et De Lellis 1988). Elles sont caractérisées par leurs granules de petite taille ressemblant à des vésicules synaptiques (Kobayashi et al. 1978).. Capsule Zone glomérulée Zone fasciculée Zone réticulée Plexus capsulaire. Médullaire. Veine centrale de la médullaire. Figure (2) : Schéma représentant les différentes zones et la vascularisation de la glande surrénale (D’après Wheater 1979).. 11.

(15) 1.2- Les messagers biologiques des cellules chromaffines Chez les mammifères, plus de vingt neuropeptides différents ont été mis en évidence dans les cellules chromaffines. Des molécules biologiquement actives ont été colocalisées dans les granules chromaffines, comme par exemple le calcitonin gene related peptide (CGRP), le neuropeptide Y, l’adrénaline et la noradrénaline, les chromogranines, la substance P, la somatostatine, le peptide vaso-actif intestinal (VIP), les facteurs de croissance, les interleukines, la galanine et la sérotonine (Saito et al. 1984 ; Kurmato et al. 1985 ; Kondo 1985 ; Laslop et al. 1989 ; Holfe et al. 1991; Holst et al. 1991 ; Unsicker et Stögbauer 1992 ; Anderson et al. 1992). La sécrétion de ces messagers biologiques à partir des granules chromaffines peut être induite par stimulation des fibres préganglionnaires du nerf splanchnique ou stimulation des récepteurs nicotiniques présents sur la membrane cytoplasmique cellulaire. Les messagers seraient libérés dans l’espace extracellulaire et leur action pourrait s’exercer sur les cellules chromaffines dont ils proviennent (sécrétion autocrine), sur les cellules voisines (sécrétion paracrine) ou sur des cellules encore plus éloignées atteintes après leur passage dans la circulation générale. De plus, la membrane du granule chromaffine est remarquable par le grand nombre de protéines différentes qu’elle contient. Les techniques électrophorétiques indiquent la présence de plus de 40 polypeptides différents (Abbs et Phillips 1980). Parmi les fonctions assurées par ces protéines, certaines sont spécifiques des granules chromaffines. Par exemple, la protéine majeure de la membrane granulaire est une enzyme de la chaîne de synthèse des catécholamines, la dopamine–β-hydroxylase (DβH). On trouve également une pompe à proton fournissant l’énergie nécessaire à l’accumulation et au transport des catécholamines. Dans la matrice du granule, on trouve par ordre d’importance des catécholamines, de l’ATP et d’autres nucléotides, de l’acide ascorbique et des ions calcium en grande concentration (Benchimol et al. 1977). Les catécholamines et l’ATP sont concentrées dans le granule grâce à l’énergie fournie par un gradient électrochimique formé par l’ATPase membranaire. De plus, le granule chromaffine contient différentes protéines dont la DβH, ainsi que toute une famille de protéines acides, les chromogranines, et un certain nombre de peptides tel que les enképhalines et leurs précurseurs (Carmicheal et Winkler 1985). 1.3 -Les produits sécrétés et les mécanismes de sécrétion Les produits de sécrétion peuvent être classés en trois grandes catégories : les amines biogènes, les neuropeptides et les facteurs de croissance. Des molécules associées aux granules de sécrétion, telles que les chromogranines, pourraient également être libérées avec ces substances (Holfe et al. 1991). 12.

(16) La présence de peptides opioïdes a été mainte fois signalée dans la surrénale des mammifères (rat, bovin) y compris chez l’homme, mais d’importantes différences interspécifiques concernant leur distribution ont été mises en évidence (Pelto-Huikko 1989). Il a été montré que, près d’un quart des cellules chromaffines du rat seraient enképhalinergiques (Kondo 1985). Cet auteur rapporte une localisation également distribuée entre les cellules adrénergiques et noradrénergiques (Kondo 1985). Les cellules chromaffines contiennent des peptides de type opiacés (Denis et al. 1982). Il a été également démontré que le principal site de stockage des enképhalines se situe dans les granules des cellules chromaffines. Ces peptides opiacés sont libérés en même temps que les catécholamines, lorsque les cellules sont stimulées (Viveros et Wilson 1983). Les cellules chromaffines sont catécholaminergiques. Elles synthétisent toutes de la noradrénaline et de la dopamine ; la majorité d’entre elles possèdent de la phényléthanolamine-N-méthyl-transferase (PNMT) et synthétisent de l’adrénaline. La présence de PNMT permet de distinguer les cellules chromaffines adrénergiques des cellules noradrénergiques. Il existe des différences interspécifiques quant à la nature des cellules chromaffines de l’adulte. Chez le cobaye et le lapin toutes les cellules sont noradrénergiques, par contre, chez l’homme seulement 5 % des cellules sont noradrénergiques (Benchimol et Cantin 1977). Les catécholamines et l’ATP sont concentrées dans le granule grâce à l’énergie fournie par un gradient électrochimique formé par l’ATPase membranaire. Cette protéine accumule des protons dans le granule chromaffine en hydrolysant l’ATP. Cette accumulation acidifie fortement l’intérieur du granule créant ainsi un gradient électrochimique, c’est-à-dire un gradient de pH et une différence de potentiel membranaire. La synthèse des catécholamines au sein des cellules chromaffines se compose de quatre étapes principales, la première étape concerne la transformation de la tyrosine en dihydroxy phényle alanine (DOPA) par l’enzyme cytoplasmique, la tyrosine hydroxlase (TH) qui représente l’enzyme limitante de la biosynthèse des catécholamines endogènes. La TH ne se trouve qu’au niveau des neurones catécholaminergiques et des cellules chromaffines des glandes surrénales. La TH est une enzyme saturable, son activité est modulée à court terme par phosphorylation, assurée par la protéine kinase A, et par diverses protéines en réponse au "Nerve Growth Factor"(NGF), au neuropeptides VIP et à la substance P. A long terme, l’expression de la TH est aussi régulée négativement par la disponibilité en noradrénaline ou en adrénaline (régulation de la transcription du gène de la TH) (Nagatsu et Stjarne 1998). La deuxième étape, également cytoplasmique, concerne la décarboxylation de la DOPA en dopamine par la DOPA décarboxylase.. 13.

(17) La dopamine cytosolique est ensuite concentrée dans les granules de stockage par l’intermédiaire de transporteurs vésiculaires commun à toutes les monoamines, le VMAT-1 et 2 (vesicular monoamine transporter). L’énergie nécessaire à ces transports est issue du fonctionnement de l’ATPase vésiculaire ou V-ATPase. C’est une H+-ATPase qui assure un courant entrant de protons, permettant l’entrée des neuromédiateurs dans les vésicules par le transporteur vésiculaire.. Figure (3) : Schéma représentant la biosynthèse des catécholamines au sein de la cellule chromaffine.. La troisième étape a lieu à l’intérieur du compartiment granulaire et consiste en une β-hydroxylation de la dopamine en noradrénaline par la dopamine-β-hydroxlase (DβH). L’enzyme s’y trouve en partie, sous forme libre et en partie sous forme liée à la membrane granulaire. L’étape finale consiste en une N-méthylation de la noradrénaline en adrénaline par l’enzyme, phényléthanolamine-N-méthyl transférase (PNMT), enzyme cytoplasmique des cellules chromaffines. La noradrénaline doit donc auparavant quitter les granules de stockage (par diffusion) selon ce gradient de concentration et rejoindre le cytoplasme. L’adrénaline cytosolique est ensuite concentrée dans les granules de stockage par les transporteurs vésiculaires. 14.

(18) La cellule chromaffine stimulée libère ses produits de sécrétion par exocytose. L’aspect morphologique ultrastructural de ce mécanisme est actuellement bien connu, il s’agit d’une fusion de la membrane du granule avec la membrane plasmique, permettant la continuité entre l’espace intra-vésiculaire et l’espace extracellulaire et donc le passage des produits vers la circulation sanguine (Bader et al. 2002). La sécrétion est contrôlée par différents types de récepteurs (cholinergiques, opiacés et adrénergiques) et par les canaux ioniques. La cellule chromaffine possède des récepteurs nicotiniques et muscariniques. L’activation des récepteurs nicotiniques produit une entrée de calcium du milieu extracellulaire vers le cytoplasme de la cellule (Kao et Schneider 1986). Ceci induit la libération des catécholamines stockées, ainsi qu’une augmentation du taux d’adénosine mono phosphate cyclique (AMP) qui provoque une synthèse accrue des produits de sécrétion (Eiden et al. 1984). Le rôle des récepteurs muscariniques est plus complexe car il dépend des espèces animales étudiées. Certains auteurs parlent d’un rôle activateur, d’autres d’un rôle inhibiteur (Kilpatrick et al. 1980). Elles possèdent également au niveau de la membrane plasmique des récepteurs aux opiacés spécifiques qui auraient un rôle modulateur du niveau des récepteurs nicotiniques (Castanas et al. 1984). Plusieurs équipes ont ainsi pu montrer que certains peptides comme la dynorphine, la β-endorphine et les enképhalines inhibent la sécrétion induite par la nicotine ou l’acétylcholine dans les cellules chromaffine en culture (Livett et Boska 1984). Certaines études mettent en évidence la présence de récepteurs α et β adrénergiques au niveau de la membrane plasmique des cellules chromaffines. Il semblerait que les récepteurs de type α inhibent la sécrétion des catécholamines en réponse à l’acétylcholine, alors que les récepteurs de type β auraient un effet stimulant (Greenberg et Zinder 1982 ; Sakurai et al. 1983). L’activation du récepteur nicotinique par l’acétylcholine provoque l’ouverture d’un canal associé à l’entrée de calcium et de sodium dans la cellule. Ceci entraîne alors une dépolarisation de la membrane plasmique et l’ouverture de deux types de canaux voltage dépendant (canal sodium et canal calcium). L’élévation de la concentration intracellulaire de calcium déclenche les mécanismes de sécrétion et active un canal potassium. Ce canal potassium, en permettant la sortie du potassium intracellulaire, repolarise la membrane plasmique et entraîne la fermeture des canaux voltage dépendants (Marty 1981). Le potentiel de repos de la cellule est maintenue par une ATPase Na/K dépendante. Enfin, il faut encore noter la présence, au niveau de la membrane plasmique, d’un canal chlore couplé à un récepteur de type GABAergique (Bormann et Clapham 1985). Ces courants chlores activés par le GABA sont hyperpolarisants et peuvent, de ce fait, avoir un effet inhibiteur sur la sécrétion des catécholamines induite par l’acétylcholine. 15.

(19) 2- Stratégie de greffe des cellules chromaffines Le principe est de transplanter des cellules chromaffines dans l’espace sousarachnoïdien péri-médullaire pour qu’elles se comportent comme de véritables mini pompes biologiques (Czech et Sagen 1995), en libérant de manière continue dans le système nerveux central des substances neuroactives analgésiques telles que des peptides opioïdes et des catécholamines (Wilson et al. 1982).. Figure (4) : Schéma représentant la stratégie de greffe des Cellules chromaffines dans l’espace sous arachnoïdien.. Ces produits agiraient de façon indépendante, mais également synergique au niveau des récepteurs opioïdes et α-adrénergiques de la jonction radiculo-médulaire en bloquant la transmission du message nociceptif. Ces cellules, par l’intermédiaire de leurs récepteurs nicotiniques, pourraient être stimulées de manière à accroître la libération de ces neuropeptides aux propriétés analgésiques (Sagen et Pappas 1986 ; Sagen et Kemmler 1989 ; Sagen et al. 1991 ; Yakash et Malmberg 1994). Les cellules chromaffines sécrètent également de nombreux facteurs neurotrophiques, impliqués dans l’hyperexcitabilité et la survie des neurones de la corne postérieure lors de lésions périphériques nerveuse ou inflammatoire (Coupland 1989 ; Unsicker 1993).. 16.

(20) Différentes études pré-cliniques ont apporté des nouvelles données supportant l’utilisation de la greffe de cellules chromaffines comme une thérapie potentiellement efficace dans le traitement de la douleur chronique (Sagen et al. 1990 ; Czech et Sagen 1995 ; Wang et Sagen 1995 ; Yu et al. 1998a, b; Sol et al. 2004). Dans plusieurs modèles de douleur aiguë ou chronique, les greffes de tissu médullosurrénalien ont induit chez l’animal, une analgésie durable sans neurotoxicité ni phénomènes de tolérance (Wang et Sagen 1995). Ces études ont montré que la transplantation de cellules chromaffines dans l’espace sous-arachnoïdien, peut considérablement réduire la sensibilité à la douleur dans des modèles expérimentaux de douleur chronique bien établis tels que le rat arthritique (Sagen et al. 1986 et 1991 ; Wang et Sagen 1995). Il a été également montré que l’effet analgésique est dû à la libération simultanée de catécholamines et de peptides opioïdes (Sagen et Kemmler 1989 ; Sagen et Pappas 1990 ; Sagen et al. 1991). Ces bases expérimentales ont permis d’envisager différents essais cliniques d’allogreffe chez des patients présentant des douleurs chroniques. La première application de ces propriétés cellulaires des cellules chromaffines pour contrôler des douleurs cancéreuses chez l’homme a été rapportée par Vaquero (Vaquero et al. 1989). Les résultats de cette étude initiale incluant deux patients avec un suivi limité (16 jours à 4 semaines), ont été considérés comme transitoires et non satisfaisants. Dans la seconde série de 5 patients correspondant à l’étude préliminaire de l’Université de l’Illinois, les résultats étaient plus significatifs avec une amélioration des scores de la douleur et une réduction de la consommation de morphine chez quatre des patients (Sagen et al.1993 ; Winnie et al. 1993). Ces succès ont initié d’autres études cliniques prometteuses (Lazorthes et al. 2000a). La procédure d’allogreffe de cellules chromaffines humaines bien que très prometteuse dans le traitement des douleurs cancéreuses essentiellement, présente des limites qui excluent leur généralisation. Afin d’obtenir une efficacité analgésique post-greffe, il est impératif que le tissu médullosurrénalien prélevé conserve des qualités fonctionnelles et soit en en quantité suffisante. Ceci nous amène au problème de faible disponibilité de tissu humain (dons d’organes) et par conséquent à l’approvisionnement en tissu médullosurrénalien transplantable. L’utilisation de sources cellulaires alternatives telles que les cellules chromaffines xénogéniques provenant du bétail consommable (bovin ou porc), rendrait la technique de transplantation intra-thécale de cellules chromaffines largement utilisable dans le traitement des douleurs chroniques rebelles (Czeck et al. 1995 ; Hentall et Sagen 2000).. 17.

(21) Depuis les travaux initiaux de Sagen en 1986 (Sagen et al. 1986a, b), les cellules chromaffines bovines représentent le modèle le plus souvent utilisé en thérapie cellulaire de la douleur. Les cellules chromaffines bovines bien caractérisées en culture, présentent l’avantage de pouvoir être facilement isolées et purifiées à partir de glandes animales, et sont aussi capables de survivre pendant des périodes très prolongées dans le système nerveux central du rat après un traitement court immunosuppresseur (Sagen et al. 1990). Les études pré-cliniques, utilisant les cellules xénogéniques bovines, ont cependant donné des résultats contradictoires. Les premières études ont montré que les cellules en suspension greffées dans l’espace intra-thécal du rat, produisaient une activité analgésique durable aussi bien dans des modèles de nociception (douleur aiguë) que dans des douleurs neuropathiques (Hama et Sagen 1994 ; Sagen et Pappas 1987 ; Sagen et Pappas 1988). Ces résultats ont été récemment remis en question par quelques équipes. En effet, ces équipes n’ont pas retrouvé d’activité analgésique chez le rat après greffe intra-thécale des cellules allogéniques ou xénogéniques bovines dans des modèles de douleur aiguë et subaiguë (Linder et al. 2000 ; Gulwadi et al. 2002). Malgré le privilège immunologique du système nerveux central (Winder et Brundin 1988), les transplants xénogéniques dégénèrent rapidement dans le SNC (Tkakzuk et al. 2000) si un traitement immunosuppresseur de courte durée n’est pas mis en place (Ortega et al. 1992). Mais, les effets indésirables, notamment digestifs, et la toxicité à long terme de la ciclosporine (hépatotoxicité, néphrotoxicité,…) suscitent de sérieuse réserves vis-à-vis d’une telle stratégie thérapeutique, tandis que les risques de rejet immunitaire demeure en outre importants. D’où l’idée d’apposer un immuno-isolement sous forme d’une membrane enveloppant les cellules, c’est-à-dire la bio-encapsulation (Lim et Sun 1980).. 18.

(22) 3- Le concept d’immuno-isolement et le biomatériau Afin d’éviter le traitement immunosuppresseur, la technique d’encapsulation des cellules vivantes a été proposée (Lim et Sun 1980). Les capsules sont formées à partir d’un ou plusieurs polymère(s) biocompatible(s) composant une membrane semi-perméable qui permet une diffusion dans les deux sens de substances de faible poids moléculaire telles que les nutriments, les électrolytes, l’oxygène et les facteurs neurotrophiques de l’hôte. En même temps les membranes jouent le rôle de barrière vis-à-vis des molécules de gros poids moléculaire telles que les immunoglobulines, les facteurs lytiques du complément ou les cellules du système immunitaire (Lim et Sun 1980 ; Aebischer et al. 1988 ; Basta et al. 2004).. Figure (5) : Concept d’immuno-isolement (D’après American Society of Pain : ASP).. Bien évidement en plus de ce concept d’immuno-isolement, il est nécessaire que les biomatériaux qui permettront l’encapsulation cellulaire soient biocompatibles, tolérés, non toxique et non carcinogène (Thomas 1993 ; De Vos et al. 1993 ; Li 1998). Un biomatériau est un matériau inerte, susceptible d’être implanté chez l’homme ou en tout cas d’être exposé à ses fluides biologiques (Peronneau 1981). Les biomatériaux sont des polymères, des céramiques, des matériaux naturels. La biocompatibilité d’un biomatériau est définie par sa capacité d’interagir avec l’organisme hôte, entraînant une réponse appropriée de ce dernier dans une application spécifique (William 1987). Les biomatériaux doivent répondre à des normes précises pour une application définie. Ces normes rendent compte des réactions entre le biomatériau et les tissus et sont définies par l’Association Française de Normalisation (AFNOR). Leur vérification implique la réalisation d’études concernant la toxicité sur culture cellulaire, l’irritation de la peau, l’implantation à long terme (tolérance), la carcinogène, la compatibilité sanguine et la sécurité (test des pyrogènes).. 19.

(23) La réaction de l’organisme à la présence d’une capsule (polymère) se traduit par la formation d’une coque fibreuse qui modifie la cinétique des échanges entre les deux et peut provoquer l’échec de la greffe (De Vos et al. 2002 ; Darrabie et al. 2005). La biocompatibilité d’un biomatériau est évaluée par les caractéristiques de cette coque fibreuse qui entoure la membrane de la capsule : elle est composée de macrophages, de lymphocytes, de fibroblastes, de cellules géantes multinuclées (Okada et al. 1997, Strand et al. 2001). ). Egalement, il a été montré que des facteurs d’adhésion cellulaire et de nombreuses protéines tels que la fibronectine, la transferrine et les protéines du complément adhérent à la surface des microcapsules implantées en provoquant leur dégradation protéolytique (Van Raamsdonk et al. 2002). Ces protéines sont capables de s’adsorber sur un polymère par de multiples interactions selon son caractère hydrophobe ou hydrophile, c’est-à-dire selon la polarité positive ou négative de la surface de la membrane (Andrade et Hlady 1986). Dans la figure 6 est schématisé de telle interaction.. Figure (6) : Représentation schématique de l’interaction protéine/surface (D’après Andrade 1986).. En effet, l’adsorption de l’albumine et du fibrinogène au niveau des différentes membranes polymériques augmente avec le caractère hydrophobe des surfaces membranaires. Par contre, l’adsorption protéique sur une surface hydrophile est considérablement diminuée. Les propriétés hydrophiles des membranes artificielles conditionnent l’absence d’adhésion cellulaire et la biocompatibilité membranaire (Andrade et Hlady 1986).. 20.

(24) 4- Macroencapsulation versus Microencapsulation Durant ces dernières années les techniques d’encapsulation cellulaire ont été bien établies du fait que les polymères sont mieux connus en terme de composition, de réactivité et de pureté après extraction (Uludag et al. 2000). Dans le cadre de l’encapsulation de cellules mammifères, on peut distinguer d’une part les macrosystèmes et d’autre part les microsystèmes. Les techniques de macroencapsulation incluent l’encapsulation en fibre creuse et en large feuillet "large flatt-sheet". Celles de microencapsulation reposent sur des procédés de gélification thermo-réversible ou ionotropique, de polymérisation interfaciale, de coacervation ou d’interaction entre polyélectrolytes de charges opposées (Uludag et al. 2000).. * La macroencapsulation Les macrosystèmes prennent le plus souvent l’aspect de fibres creuses, d’une taille comprise entre 0,5-1,5 mm de diamètre et d’une longueur comprise entre 1-10 cm (Li 1998). La taille de ces macrosystèmes dépend des conditions de fabrication, elle est conçue en fonction des applications particulières (Tresco 1992). Ainsi, les macrosystèmes développés par l’équipe de Joseph sont des fibres creuses de 5 cm de long et de 900 µm de diamètre externe (Joseph et al.1994). Ils peuvent en fonction de leur volume contenir plusieurs millions de cellules (Aebischer et al. 1991 ; Joseph et al. 1994 ; Date et al. 2000 ; Broadhead et al 2002). C’est pour cette raison qu’il est nécessaire d’en implanter très peu (souvent un seul), ce qui représente un attrait considérable. Ces dispositifs sont composés d’une membrane semiperméable sélective et d’une matrice interne où se trouvent les cellules comme il est présenté dans la figure 7. Les membranes des macrosystèmes sont sous forme de fibres creuses préformées, stérilisées, remplies par un orifice avec les cellules, puis fermées à l’aide d’une colle (Buchser 1996).. Figure (7) : Immuno- isolement sous la forme d’une fibre creuse (D’après Li 1998).. 21.

(25) * La membrane est typiquement formulée avec des polymères synthétiques, insolubles dans l’eau tel que le copolymère de polyacrylonitrile et de chlorure de polyvinyle (PAN/PVC) (Hymer et al. 1981 ; Jaeger et al.1992 ; Gentile et al. 1995 ; Broadhead et al. 2002). * Le choix de la matrice interne dépend du type cellulaire à encapsuler. Dans leur environnement natif, les cellules vivent dans un réseau complexe de protéines extracellulaires et de molécules polysaccharidiques nommée matrice extracellulaire (ECM) qui ont un rôle complexe et dynamique dans les fonctions cellulaires. Les deux rôles majeurs de cette matrice interne sont : - un rôle mécanique, elle immobilise les cellules, ce qui permet une distribution homogène dans toute la fibre creuse ; - un rôle biologique : elle stimule les cellules à sécréter leur propre ECM, régule leur prolifération cellulaire, et leur fonctions sécrétoires et maintient les cellules dans un phénotype différencié (Sagen et al. 1999). Les matrices internes sont le plus souvent des hydrogels à base d’alginate de sodium, de collagène, de chitosan ou d’agarose (Iwata et al.1992 ; Li 1998 ; Uludag et al. 2000 ; Kumar et al. 2000 ; Agnihortri et al. 2004). Des études relativement récentes ont démontré l’efficacité des systèmes immunoisolants sous la forme de fibre creuse, contenant des cellules chromaffines xénogéniques. Tout d’abord, le groupe de Sagen (suite aux nombreuses implantations de cellules chromaffines dans l’espace sous arachnoїdien) a réitéré ses expériences avec des cellules chromaffines bovines encapsulées dans des fibres creuses en PAN/PVC. Chaque rat a reçu entre 2 et 6 millions de cellules chromaffines bovines encapsulées. Deux semaines après la greffe, les résultats obtenus ont été encourageants : ces implants ont pu réduire la sensation douloureuse sur un modèle de douleur aiguё (Sagen et al. 1993). En 1998, Yu et ses collègues ont initiés deux études sur des rats dans un modèle de douleur neuropathique. Dans la première, ce sont 1 X 105 cellules chromaffines bovines (CCB) qui ont été implantées (Yu et al. 1998a). Dans la seconde, ce sont 2,5 X 105 cellules chromaffines qui ont été encapsulées dans une fibre creuse à matrice interne à base d’alginate de sodium (Yu et al. 1998b). Dans la première étude, peu de cellules ont survécu cinq semaines après la greffe. En revanche, dans le deuxième cas 60 % à 80 % des cellules encapsulées étaient toujours viables deux mois après l’implantation. La membrane de ces macrosystèmes a certainement protéges les cellules chromaffines vis-à-vis de la réaction immunitaire de l’hôte (Yu et al. 1998b). Cependant dans les deux cas, une analgésie durable n’a pas être obtenue au niveau des tests réalisés, ceci en raison du nombre insuffisant de cellules implantées (Yu et al. 1998). 22.

(26) D’autres études ont été réalisées sur un animal de taille plus proche de l’humain, le mouton. 2 x 107 CCB encapsulées dans une fibre creuse en PAN/PVC furent implantées dans l’espace sous arachnoїdien. Cette étude a démontré que ces CCB encapsulées pouvaient survivre et rester fonctionnelles sans traitement immunosuppresseur, pendant une durée allant jusqu’à 8 semaines (Josef et al. 1994). Des études similaires, toujours sur le mouton ont permis d’affirmer le concept d’immuno-isolement et la survie des cellules implantées (Kaplan et al. 1996). Un article récent (Winn et Emerich 2005) rapporte une expérience du même type, sur le même animal où 2,2 x 106 CCB ont été encapsulées dans une fibre creuse. Au bout de 6 semaines, après l’explantation des CCB encapsulées, le taux de noradrénaline et de metenképhaline avait augmenté dans le liquide cérébro-spinal (LCS) (Winn et Emerich 2005). Les implants ont été bien tolérés, mais aucun test permettant d’évaluer l’effet analgésique des cellules chromaffines bovines implantées n’a été réalisé dans ce travail. Une étude clinique pilote a été initiée, impliquant des patients cancéreux au stade terminal souffrant de douleurs rebelles (Aebischer et al. 1994). Ces patients ont reçu 2 x 106 de CCB encapsulées par l’intermédiaire d’une fibre creuse d’un diamètre de 1 mm et d’une longueur de 5 cm. La membrane de la fibre creuse, réalisée en PAN/PVC, avait une surface lisse et la matrice interne était constituée d’alginate de sodium. L’implantation de ces fibres creuses dans l’espace sous arachnoїdien reste délicate et relativement invasive. Dans l’expérience rapportée, elles sont été retirées au bout de 3 mois pour le contrôle et le traitement a été interrompu (Aebischer et al. 1994). Un autre essai clinique de phase I (Buchser et al. 1996) concernant 15 patients cancéreux en phase terminale montre que certains de ces patients ont gardé en place leurs implants près d’une année, d’autres ont pu réduire l’apport morphinique. Ces résultats montrent que les cellules implantées sécrètent des substances analgésiques (Buchser et al. 1996). Cependant, cette sécrétion n’est pas toujours corrélée à un effet analgésique, peut être pour des raisons de quantité insuffisante de cellules implantées. L’équipe de Linder a également implanté 1 x 105 CCB encapsulées dans des fibres creuses au niveau des ventricules cérébraux des rats sur un modèle de douleur neurogène et dans l’espace sous arachnoїdien de rats sur un modèle de douleur subaiguё sans retrouver aucun effet analgésique significatif (Linder et al. 2000). Au vu des résultats obtenus par les différentes équipes, l’encapsulation de cellules chromaffines dans des fibres creuses répond aux pré-requis de biocomptabilité, d’immunoisolement et de permi-sélectivité nécessaires à l’utilisation de tels systèmes. Cependant, ces implants présentent un certain nombre de désavantages dont leur surface de diffusion limitée. De ce fait, le relargage des principes actifs et la survie à long terme des cellules restent à optimiser (Emerich et al. 1992). 23.

(27) Le modèle de la microencapsulation semble être, de par son principe, un système plus adapté à un maintien des échanges transmembranaires de nutriments et de substances biologiquement actives proches de ceux observés dans les conditions physiologiques en permettant une meilleure viabilité de cellules encapsulées (Emerich et al. 1992 ; Uludag et al. 2000).. *Le microencapsulation Ce terme est employé pour désigner une encapsulation dans des particules de dimensions allant de 0,3 à 1,5 mm (Uludag et al 2000). On parle de microsphères lorsqu’il s’agit de particules pleines et de microcapsules lorsqu’elles sont constituées d’un cœur et une membrane. Lorsque le cœur de la microcapsule est liquide, on parle alors de microcapsules creuses. En comparaison avec les macrosystèmes, elles possèdent différents avantages : - elles sont résistantes du fait de leur taille et leur forme sphérique et peuvent subir des contraintes relativement élevées avant de se rompre. - elles ont également un meilleur rapport volume/surface permettant une meilleure diffusion de molécules à bas poids moléculaire au travers de la membrane. Cependant, dans un but d’efficacité, leur volume interne plus petit impose d’en implanter un plus grand nombre ou de remplir les microcapsules par un grand nombre de cellules (Li 1998 ; Uludag et al. 2000). Un grand nombre d’études ont été réalisées avec les cellules de la lignée PC12 dérivée d’un phéochromocytome de rat (Winn et al. 1991 ; Mercier et al. 2001). En revanche, il existe très peu d’études disponibles concernant les cellules chromaffines microencapsulées dans le traitement des douleurs chroniques rebelles. Deux études récentes ont été initiées avec des cellules chromaffines bovines microencapsulées dans un système d’alginate-PLL-alginate (Kim et al. 2004 ; Jeon et al. 2006). Ces cellules chromaffines microencapsulées (2,5 x 105) ont été implantées dans l’espace sous arachnoïdien de rats, présentant un modèle de douleur neurogène. Un mois après l’implantation, ces cellules chromaffines microencapsulées possèderaient des propriétés analgésiques dans ce modèle.. 24.

(28) 5- Alginate et encapsulation Des polymères synthétiques ou naturels présentant la propriété de former des hydrogels sont utilisés dans l’encapsulation de cellules vivantes (Li 1998 ; Uludag et al. 2000 ; Kumar et al. 2000 ; Agnihortri et al. 2004). Le polymère le plus couramment employé dans le domaine d’encapsulation des cellules vivantes est l’alginate de sodium en raison notamment de son absence de toxicité, et de sa dispersion aisée dans l’eau en formant une solution visqueuse. Les alginates sont des molécules issues d’algues marines. Ils peuvent facilement être purifiés sans perte de leur composition moléculaire. Au cours de ces dernières années, plusieurs techniques de purification d’alginate (filtration, précipitation et extraction) ont été décrites (Klock et al. 1994 ; De Vos et al. 1997 ; Bünger et al. 2003). Pour l’encapsulation cellulaire la pureté de l’alginate doit être mise en considération : plus l’alginate est pur, plus les microcapsules sont stables, lisses et par conséquence biocompatibles (Klock et al. 1994 ; De vos et al. 1997 ; Juste et al. 2005).. Figure (8): Structure chimique (a) de l’acide mannuronique et de l’acide guluronique ; (b) de l’alginate.. D’un point de vue chimique (figure 8), les alginates sont des polysaccharides constitués d’enchaînements linéaires de résidus d’acides β-D-mannuroniques (M) et d’acides α-L-guluroniques (G) liés en 1-4 selon des proportions et des arrangement variables (Haug et Larsen 1962 ; Smidsrod et Haug 1968). Des séquences homopolymériques de résidus Dmannuroniques (blocs M-M) et des séquences similaires de résidus guluroniques (blocs G-G), sont séparées par des séquence mixtes (blocs M-G). 25.

(29) L’alginate est un polysaccharide chargé négativement, il gélifie en présence d’ions divalents tels que le Ca+2 et le Ba+2 (Clark et Ross-Murphy 1987). La gélification de l’alginate de sodium en présence d’ions divalents se fait selon le modèle de la « boite à œufs » (Grant et al. 1973). Généralement, le sel de cation divalent le plus souvent utilisé pour la gélification de l’alginate est le chlorure de calcium qui est très soluble dans l’eau et qui offre une bonne disponibilité des ions calcium. Il a été montré que 90 % des ions sodium contenus dans une solution d’alginate de sodium peuvent être facilement déplacés par des ions calciques (Seely et Hart 1974). L’alginate de sodium se transforme alors en alginate de calcium qui gélifie.. Figure (9) : Gélification de l’alginate par les ions calcium et le modèle en boite à œufs. Les propriétés des microsphères d’alginate dépendent du type d’ion divalent, du rapport acide mannuronique/acide guluronique de l’alginate ; ainsi que de sa masse moléculaire et de sa concentration (Clark et Ross-Murphy 1987 ; Martinensen et al. 1989 ; Stokke et al. 1997 ; Stabler et al. 2001). * Influence du type d’ion divalent En effet, l’affinité des alginates pour les différents ions est variable: Ils peuvent être classés dans l’ordre décroissant suivant leur affinité : Pb+2 = Cd+2 > Ba+2 > Ca+2 = Sr+2 >> Mg+2 (Seely and Hart 1974). * Influence de la composition chimique de l’alginate : Haug et Smidsrod, ont montré en 1965 que l’affinité pour l’ion calcium varie avec les types d’alginates. Les alginates riches en acide guluronique ont une affinité supérieure à ceux riches en acide mannuronique. Les blocs G-G sont caractérisés par la formation d’une liaison sélective et forte avec les ions calcium (Rokstad et al. 2003). En revanche, les autres types de blocs ont une sélectivité moindre pour le calcium, et n’établissent pas de liaison forte avec cet ion (Smidsrod 1972).. 26.

(30) En 2006, une étude évaluant l’influence de différents blocs sur l’affinité de l’alginate pour les différents ions a été effectuée. Les résultats de cette étude montrent que les ions Ca+2 ont une affinité plus spécifique pour les blocs G et MG, que les ions Ba+2 pour les blocs G et M ou les ions Sr+2 pour les blocs G (MØrch et al 2006). * Influence de la masse moléculaire de l’alginate et de sa concentration : La sphéricité des microcapsules est fonction de la viscosité de la suspension de la solution d’alginate qui à son tour dépend de la concentration en alginate et de sa masse moléculaire (Lim et Sun 1980 ; Lim et Moss 1981). La gélification de l’alginate en présence d’ions divalents permet d’envisager la préparation de microsphères par gélification ionotropique selon un mode simple et rapide et sans traitement chimique agressif pour les cellules à encapsuler qui conservent alors une bonne viabilité (Seely et Hart 1974 ; Smidsord et Skjak-Braek 1990 ; Klock et al. 1994). Cependant, cette technique de préparation n’est pas compatible avec tous les milieux de culture : en présence d’ions complexant le calcium tels que les phosphates une liquéfaction des microcapsules a été observée (Levy et Poncelet 1994). Cet inconvénient peut éventuellement être contourné par un traitement ultérieur des billes. Une autre possibilité est la formation d’une couche extérieure formée d’un polycation (polyélectrolyte) de charge opposée à l’alginate (via une association ionique entre les deux) ; elle représente le moyen le plus facile et le plus utilisé pour former des microcapsules stables. En 1980, l’équipe de Lim et Sun aux Etats Unis, proposait le recouvrement des billes d’alginate avec un polycation de charge opposée à l’alginate, la poly-L-lysine (PLL), qui déplace le calcium à la surface des microsphères, forme une complexe d’alginate-PLL plus stable et crée ainsi une membrane rigide semi-perméable (Lim et Sun 1980). Depuis, la PLL a parfois été incriminée lors de réactions immunitaires de l’hôte (Vandenbossche et al. 1993 a, b ; Strand et al. 2001, 2002 ; De vos et al. 2002 ; Juste et al. 2005). En fait, l’interaction ionique entre l’alginate et la PLL dépend de la composition chimique de l’alginate. Puisque les ions Ca+2 ont une affinité plus spécifique aux blocs G, l’association ionique entre les alginates à forte teneur en acide mannuronique et la PLL est plus forte que celle des alginates riches en acide guluronique. Dans ce dernier cas, il existerait alors une association incomplète entre la PLL et l’alginate à forte teneur en acide guluronique. Ce serait les charges positives résiduelles de la PLL non associées qui attireraient et stimuleraient les cellules responsables de la réponse immunitaire (Vandenbossche et al. 1993 ; Strand et al. 2001).. 27.

(31) L’ajout d’une couche extérieure supplémentaire d’alginate en surface des microcapsules diminuerait la réaction immunitaire de l’hôte (Thu et al 1996 ; De Vos et al. 1997). Le système alginate-PLL-alginate (APA) est donc considéré comme étant le complexe de choix pour l’encapsulation de cellules vivantes et pour des applications in vivo (Stang et al. 1993 ; Thu et al.1996 ; Kendall et al 2001 ; Yoshioka et al. 2003; De vos et al. 1996, 2002 et 2003 ; Kim et al. 2004 ; Bünger et al. 2005 ; Jeon et al. 2006). Plusieurs facteurs conditionnent la porosité et la solidité de la membrane complexe APA : le poids moléculaire de PLL, la concentration en PLL et le temps de contact entre l’alginate et PLL (Goosen et al. 1985 ; King et al. 1987 ; Martinsen et al .1989 et 1992 ; Thu et al. 1996 ; Vandenbossche et al. 1993 ; Leblond et al. 1996 ; De vos et al. 1997 ; Dusseault et al. 2005). En 1996, Thu lors de son étude sur l’interaction entre l’alginate et les polycations a montré que l’association ionique entre l’alginate et la PLL augmente avec la concentration en PLL, le temps de contact entre l’alginate et PLL et varie en fonction du poids moléculaire de la PLL. Selon cette étude, le poids moléculaire idéal de la PLL pour former une membrane stable serait égal à 18 kDa (Thu et al. 1996). D’autres auteurs ont montré qu’une PLL à 0,1 % de poids moléculaire de 22 kDa et un temps de réaction alginate/PLL égal à 10 minutes étaient suffisants pour obtenir une membrane de propriété immuno-protective contre les immunoglobulines (King et al.1987; Vandenbossche et al.1993). Dans l’étude de Goosen, au cours de la microencapsulation d’îlots de langerhans, la concentration en PLL était égale à 0.05 %, son poids moléculaire de 17 kDa et son temps de contact avec l’alginate était entre 6 et 8 min. Cette étude a montré que ces conditions opératoires permettaient d’obtenir des capsules parfaitement sphériques, stables et imperméables aux immunoglobulines (Goosen et al.1985). Si le temps de réaction entre alginate et PLL est augmenté au-delà de 40 min, la membrane des microcapsules est plus épaisse et compacte. Leur résistance mécanique augmente avec le temps de contact l’alginate/PLL et la concentration en PLL, au détriment de la perméabilité membranaire (King et al.1987). Par contre, une étude plus récente montre qu’un temps de contact entre l’alginate et la PLL entre 6 min et 20 min ne provoque pas de changement au niveau de la porosité des microcapsules (Darrabie et al. 2005). Une autre modification possible du procédé d’encapsulation cellulaire est la liquéfaction du cœur (alginate-calcium) de la microcapsule par l’ajout d’un séquestrant du calcium tels que le citrate de sodium ou l’éthylène glycol-bis (ß-aminoethyl éther) N,N,Ń,Ńacide tetra-acétique (Goosen et al. 1985 ; Fritschy et al. 1991).. 28.

(32) Le remplacement de cation divalent (calcium) par le cation monovalent (sodium) pourrait permettre aux cellules encapsulées une meilleure croissance (Lim et Sun 1980 ; Lim et Moss 1981 ; Goosen et al. 1985 ; Darrabie et al. 2001).. 1- Microsphère d'alginate. 2- Adsorption de polycation microcapsule. 3- Ajout d'un séquestrant du calcium microcapsule creuse. Figure (10) : Les différentes modalités de préparation de microparticules avec de l’alginate. L’ensemble de ces données montre que plusieurs paramètres fixent les conditions et les étapes de fabrication susceptibles d’influencer la stabilité, la perméabilité des microcapsules et par la même leur devenir in vivo de ces microcapsules. Une modification apparemment mineure du procédé d’encapsulation peut avoir une influence directe sur les caractères physicochimiques des microcapsules et par conséquence, sur la réponse de l’hôte contre les capsules et ainsi, sur le devenir des microcapsules (Uludag et al. 2000). Dans le cadre d’une encapsulation en vue de thérapie cellulaire, l’objectif est d’obtenir des microcapsules sphériques, résistantes et biocompatibles et de garder les cellules vivantes et fonctionnelles au sein de la capsule en les protégeant d’un rejet par l’hôte. Pour cela, nous avons testé la faisabilité de l’utilisation de microcapsules creuses d’APA pour l’encapsulation de cellules chromaffines bovines en nous intéressant plus particulièrement aux caractéristiques plysico-chimiques des microcapsules, à la viabilité et à la fonctionnalité cellulaire, avant d’envisager une implantation in vivo chez le rat.. 29.

(33) MATÉRIEL ET METHODES. 30.

(34) 1- Culture et caractérisation des cellules chromaffines bovines in vitro 1.1- Isolement et purification des cellules chromaffines bovines * Produits utilisés: - Chlorure de sodium (Sigma, S-7653) - Chlorure de potassium (Sigma, P-9541) - Bicarbonate de sodium (Sigma, S-8875) -HEPES (Sigma, H-7523) - DGlucose (Sigma, G-7528) -Collagénase A (Roche, 10103586001) - Serum albumine bovine fraction V (Sigma, A-9418) -Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F12 (DMEM/F12, Gibco, 31330-038) - Sérum de veau foetal (Sigma, F-3297) -5 fluoro5-déoxyuridine (Sigma, F-8791) -CytosineΒdarabinoside (Sigma, C-1768) -Streptomycine 10000 µg/ml / Pénicilline 10000 U/ml (Gibco, 15140-122) -Fungisone 250 µg / ml (Gibco, 15290-026). - L-Glutamine (Gibco, 25030-024). - Bleu Trypan 0.4 % (Gibco, 15250-061) *Tampons: -Tampon Locke 10 X [NaCl 1,54 M ; KCl 56 mM; DGlucose 56 mM ; NaHco3 36 mM ; HEPES 50 mM dans 1 litre d’eau milli-Q (pH = 7,2 à 20 °C)] - Tampon Locke 1X - Solution enzymatique à pH 7,2 composée de collagénase A (0,125 %), de sérum albumine bovine fraction V (0,5%), du tampon Locke 10 X mis en solution dans l’eau de Volvic. * Aux abattoirs Les glandes surrénales sont prélevées aux abattoirs de la ville de Montauban sur des animaux (veaux âgés de 6 mois), propres à la consommation. Le prélèvement est effectué dans un délai de 20 minutes après l’abattage de l’animal. Les glandes sont ensuite récupérées pour le transport (maximum 2 heures) dans une solution tampon Locke 1X à 4°C à pH 7,2 supplémentée en antibiotiques [Pénicilline (100 UI/ml)/Streptomycine (100 µg/ml) et Fungisone 2.5 µg/ml].. 31.