2. Cadres, Matériel et Méthodes d’étude
2.2. Matériel d’étude
2.2.4. Réactifs utilisés
Les réactifs de Glucose, du Cholestérol Total, du Précipitant HDL et de Triglycérides ont été utilisés.
2.3. METHODE D’ETUDE
Notre étude est prospective et prend en compte 100 sérums de sujets (Diabétiques et Non Diabétique) reçus au laboratoire d’Analyses Biomédicales de l’Hôpital de Zone de Mènontin pour le bilan lipidique classique et le dosage du glucose sur la période allant du 16 août au 16 septembre 2016.
2.3.1. Critères d’inclusion
Les sujets pris en compte sont ceux qui ont au moins 18 ans et sont restés à jeun pendant 12 heures au moins avant la prise du sang. Les prélèvements ont été réalisés sur tubes fluorés pour le dosage du glucose et sur tubes secs stériles pour le dosage des paramètres lipidiques.
2.3.2. Critères d’exclusion
Les femmes enceintes, les enfants, les sujets âgés de moins de 18 ans et les patients n’ayant pas respecté le jeune ne sont pas pris en compte.
2.3.3. Phase de manipulation 2.3.3.1.Phase pré-analytique
Les prélèvements sanguins ont été réalisés sur tubes secs stériles par ponction veineuse au pli du coude. Ces échantillons ont été centrifugés à 3000 tours/minute pendant 5 minutes.
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 12 La procédure suivie pour les manipulations est la suivante : le port de la blouse, le lavage des mains avec du savon liquide antiseptique, le port de gants, la désinfection de l’aire de travail avec de l’eau de javel 24° dilué au 1/10, la disposition des échantillons. Ensuite, la sortie des réactifs de glucose, du cholestérol total, des triglycérides du réfrigérateur (les réactifs doivent rester à la paillasse pendant au moins 10 minutes avant les manipulations) et enfin la mise en marche du spectrophotomètre SECOMAM Basic puis le suivi de la procédure de son utilisation.
2.3.3.2.Phase analytique
Dosage du glucose
Principe de la réaction du dosage du glucose Glucose oxydase
Glucose + O2 Acide gluconique + H2O2
Peroxydase
2 H2O2 + Phénol + amino 4 antipyrine Quinoneimine (rose) + 2 H2O Mode opératoire
Tableau II : Mode opératoire du dosage du glucose sur le semi-automate SECOMAM Basic
Blanc réactif Etalon Control Dosage
Réactif 1ml 1ml 1ml 1ml
Etalon - 10µl - -
Lyotrol - - 10µl -
Echantillon - - - 10µl
Incuber au bain-marie pendant 10 minutes et lire la concentration du chromogène formé à 500 nm à 37°C contre le blanc, l’étalon et le contrôle dans les mêmes conditions. Le spectrophotomètre fait la lecture des absorbances, détermine la variation de DO puis calcule la concentration de glucose contenu dans l’échantillon. Le dosage a été fait au moins deux fois sur chacun des sérums des patients pour la confirmation des résultats.
Valeurs normales (Glycémie à jeun): 0,70- 1,05 g/L
diabétiques à l’Hôpital de Mènontin
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 13
Dosage du cholestérol total Principe de la réaction du dosage
Le cholestérol total dosé par la méthode enzymatique fait intervenir un cholestérol estérase, un cholestérol oxydase et une peroxydase.
Cholestérol estérase
Cholestéride + 2H20 Cholestérol libre + Acide gras Cholestérol oxydase
Cholestérol + O2 Cholesténe- 4, one 3 + H2O2
Peroxydase
2H2O2 + Phénol + amino 4 antipyrine Quinoneimine (rose) + 2H2O Mode opératoire
Tableau III : Mode opératoire du dosage du cholestérol total sur le semi-automate SECOMAM Basic
Blanc réactif Etalon Control Dosage
Réactif 1ml 1ml 1ml 1ml
Etalon - 10µl - -
Lyotrol - - 10µl -
Echantillon - - - 10µl
Incuber au bain-marie pendant 10 minutes et lire la concentration du chromogène formé à 540 nm à 37°C contre le blanc, l’étalon et le contrôle dans les mêmes conditions. Le spectrophotomètre fait la lecture des absorbances, détermine la variation de DO puis calcule la concentration de cholestérol total contenu dans l’échantillon. Le dosage a été fait au moins deux fois sur chacun des sérums des patients pour la confirmation des résultats.
Valeurs normales : 1,20 - 2 g/l
Dosage du cholestérol HDL
Il s’effectue après précipitation sélective des LDL et VLDL par l’acide phosphotungstique en présence d’ions magnésium. Pour faire la précipitation, on prend 1ml de l’échantillon à doser et on y ajoute 100µL du réactif précipitant. Laisser reposer pendant 10 minutes à température ambiante. Centrifuger à 4000 tours/min pendant 10 minutes. Collecter le surnageant. Le cholestérol HDL est dosé sur le surnagent après centrifugation par technique enzymatique en suivant les instructions du réactif de cholestérol.
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 14 Mode opératoire
Tableau IV : Mode opératoire du dosage du HDL-cholestérol sur le semi-automate SECOMAM Basic
Blanc réactif Etalon Dosage
Réactif 1ml 1ml 1ml
Etalon - 50µl -
Echantillon - - 50µl
Incuber au bain-marie pendant 10 minutes et lire la concentration du chromogène formé à 505 nm à 37°C contre le blanc et l’étalon dans les mêmes conditions. Le spectrophotomètre fait la lecture des absorbances, détermine la variation de DO puis calcule la concentration Du HDL-cholestérol contenu dans l’échantillon. Le dosage a été fait au moins deux fois sur chacun des sérums des patients pour la confirmation des résultats.
Valeurs normales hommes : > 0,400 g/l Valeurs normales femmes : > 0,500g/l
La détermination du HDL-cholestérol a un intérêt lorsque la cholestérolémie totale est élevée.
Evaluation des LDL-cholestérol
Le dosage par précipitation sélective des LDL est peu utilisé. La formule de Friedewald permet de calculer le cholestérol LDL à condition que les triglycérides soient inférieurs à 3,5 g/l.
LDL-c (g / l) = Chol T – (HDL-c + TG / 5) Valeurs normales : < 1,6 g /l.
Dosage des triglycérides Principe
Des techniques enzymatiques sont utilisées par la majorité des laboratoires. Elles reposent sur le dosage enzymatique du glycérol libéré après action de la lipase. La technique la plus utilisée est celle utilisant le couple oxydase – peroxydase (réaction de Trinder) : Lipase
Triglycérides Glycérol + 03 Acides gras Glycérol kinase
Glycérol + ATP Glycérol 3phosphate +ADP
diabétiques à l’Hôpital de Mènontin
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Glycérol oxydase
Glycérol 3phosphate Dihydroxyacétone phosphate + H2O2
Peroxydase
H2O2+ p. chlorophénol + amino 4 antipyrine Quinoneimine + 4 H2O Mode opératoire
Tableau V : Mode opératoire du dosage des triglycérides sur le semi-automate SECOMAM Basic
Blanc réactif Etalon Control Dosage
Réactif 1ml 1ml 1ml 1ml
Etalon - 10µl - -
Lyotrol - - 10µl -
Echantillon - - - 10µl
Incuber au bain-marie pendant 10 minutes et lire la concentration du chromogène formé à 540 nm à 37°C contre le blanc, l’étalon et le contrôle dans les mêmes conditions. Le spectrophotomètre fait la lecture des absorbances, détermine la variation de DO puis calcule la concentration des triglycérides contenus dans l’échantillon. Le dosage a été fait au moins deux fois sur chacun des sérums des patients pour la confirmation des résultats.
Valeurs normales :< 1,50 g/l
2.3.3.3.Phase post-analytique
A la fin de la lecture de chacun des paramètres dosés pour chaque patient, les résultats sont portés dans le cahier de paillasse, le matériel rangé, l’aire de travail désinfectée et le semi-automate SECOMAM Basic a été éteint.
2.3.4. Méthodes statistiques
Le tableur Excel 2007 a été utilisé pour faire les analyses statistiques. Les tests utilisés sont le test t de Student au seuil de 5% et ANOVA.
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 16 3.1.RESULTATS
3.1.1. Caractéristiques de la population d’étude
Ces caractéristiques se rapportent aux donnés anthropométriques (sexe et âge) et aux différents paramètres biochimiques (CT, HDL-c, LDL-c, TG et glycémie).
3.1.1.1.Répartition des deux groupes selon les données anthropométriques (sexe et âge)
Répartition selon le sexe
Tableau VI: Répartition de la population étudiée selon le sexe et l’âge
Diabétiques Non diabétiques pa deux catégories de sujets. Il en résulte d’une part que la population d’étude est constituée de 60 diabétiques et de 40 non diabétiques. D’autre part, ce tableau montre qu’il n’existe pas une différence statistique entre l’âge moyen des hommes et celui des femmes non diabétique (p=0,12) au seuil de 5%. Mais il existe une différence significative entre l’âge moyen des hommes et des femmes diabétiques (p=0,00) et entre l’âge moyen des diabétiques et des non diabétiques (p=0,03) au seuil de 5%.
3.
RESULTATS ET DISCUSSIONdiabétiques à l’Hôpital de Mènontin
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 17
Répartition selon l’âge
Figure 1: Répartition des sujets selon les classes d’âge
La figure 1 fait part de la répartition des deux groupes de sujets selon les classes d’âge que sont : < 40 ans, [40;60 ans], > 60 ans. On constate que les diabétiques ont le plus souvent au moins 40 ans. Les non diabétiques ont majoritairement moins de 40 ans et [40;60 ans].
3.1.1.2.Répartition de la population d’étude selon les valeurs des paramètres biochimiques étudiés
L’étude est basée sur le dosage de cinq paramètres biochimiques à savoir : le taux de cholestérol total (Chol T), le HDL-cholestérol (HDL-c), le LDL-cholestérol (LDL-c), des triglycérides (TG) et de la glycémie (Gly).
Tableau VII : Valeurs des paramètres biochimiques étudiés des deux catégories de sujets
Paramètres biochimiques Diabétiques Non diabétiques pa Glycémie (g/L) Valeurs Extrêmes 1,11 - 5,42 0,70- 1,09 0,00٭
moy± ET 2,48±1,07 0,85±0,11
Cholestérol Total (g/L) Valeurs Extrêmes 1,01 - 3,2 1,06 - 2,93 0,01٭
moy± ET 1,85±0,48 1,63±0,38
HDL-Cholestérol (g/L) Valeurs Extrêmes 0,156 - 1,276 0,200 - 1,21 0,02٭
moy± ET 0,535±0,214 0,633±0,223
LDL-Cholestérol (g/L) Valeurs Extrêmes 0,250 - 2,364 0,236 - 2,230 0,28
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 18 Le tableau VII présente les valeurs extrêmes et moyennes de chacun des cinq paramètres biochimiques évalués en fonction des deux groupes de sujets. On remarque que la glycémie (p=0,00) et le cholestérol total (p=0,01) sont significativement plus élevé chez les diabétiques que les non diabétiques au seuil de 5%. Le taux de HDL-cholestérol (p=0,02) est significativement plus bas chez les diabétiques que les non diabétiques. Le taux de LDL-cholestérol (p=0,28) et de triglycérides (p=0,29) chez les diabétiques ne sont pas significativement différents de celui des non diabétiques au seuil de 5%.
Tableau VIII : Valeurs moyennes des paramètres biochimiques en fonction du sexe dans les deux groupes étudiés fonction du sexe dans les deux groupes de sujets. On remarque qu’il n’y a pas une différence significative entre les moyennes des différents paramètres étudiés chez l’homme et chez la femme aussi bien dans le groupe des diabétiques que des non diabétiques au seuil de 5%.
Mais on constate que la glycémie et le taux des triglycérides sont significativement plus
diabétiques à l’Hôpital de Mènontin
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 19
élevés chez les hommes diabétiques que les non diabétiques au seuil de 5% soit (p=0,00). La glycémie et le taux des triglycérides sont aussi significativement plus élevés chez les femmes diabétiques que les non diabétiques au seuil de 5% soit respectivement (p=0,00) et (p=0,02).
Le taux de cholestérol total est significativement plus élevé chez les hommes diabétiques que les non diabétiques au seuil de 5% (p=0,02) alors qu’il n’y a pas une différence significative entre le taux de cholestérol total des femmes diabétiques et non diabétiques. Pour les paramètres HDL-c et LDL-c, il n’existe aussi pas de différence significative entre les taux moyens de chacun de ces paramètres chez les hommes diabétiques et non diabétiques que chez les femmes diabétiques et non diabétiques.
Tableau IX : Valeurs moyennes des paramètres biochimiques en fonction des classes d’âge et des deux groupes étudiés
Le tableau IX résume les valeurs moyennes des paramètres biochimiques en fonction des classes d’âge et des deux groupes étudiés. On remarque que la glycémie des sujets quel que soit la classe d’âge considérée, est significativement plus élevé chez les diabétiques que chez les non diabétiques au seuil de 5% (p=0,00). De même, le taux moyen des triglycérides
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 20 est significativement plus élevé chez les diabétiques que les non diabétiques au seuil de 5%
quand nous considérons n’importe quelle classe soit respectivement: <40 ans (p=0,03), [40;
60ans] (p=0,02), >60 ans (p=0,02). Les taux moyens de cholestérol total et de LDL-c sont significativement plus élevés chez les diabétiques que les non diabétiques ayant moins de 40 ans au seuil de 5% soit respectivement (p=0,04) et (p=0,08). Mais il n’existe aucune différence entre le taux moyen de cholestérol total et de LDL-c des diabétiques et des non diabétiques ayant au moins 40 ans. Le taux moyen de HDL-c n’est pas significativement différent chez les diabétiques et les non diabétiques ayant moins de 40 ans et ceux ayant entre 40 et 60 ans, mais est significativement plus bas chez les diabétiques que les non diabétiques ayant plus de 60 ans au seuil de 5% (p=0,10).
Figure 2 : Répartition des deux groupes de sujets selon les types de dyslipidémies A partir des valeurs des différents paramètres lipidiques obtenues et en se référent aux valeurs normales de ces quatre paramètres (Chol T, HDL-c, LDL-c et TG), on a identifié quatre types de dyslipidémies au sein des deux groupes de sujets, ce qui est présenté par la figure 2. On remarque que les cas de dyslipidémies sont plus fréquents chez les diabétiques que chez les non diabétiques.
Figure 3 : Prévalence du risque athérogène selon les différents indices d’athérogénicité calculés chez les deux groupes de sujets
0 5 10 15
diabétiques à l’Hôpital de Mènontin
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 21
La figure 3 montre la prévalence du risque athérogène selon les différents indices d’athérogénicité calculés chez les deux groupes de sujets étudiés. On constate que le taux de dyslipidémie varie d’un rapport à un autre. Les rapports TG / HDL-c et HDL-c / Chol T sont ceux qui décèlent le plus de cas dans le groupe des diabétiques (28 cas) mais dans le groupe des non diabétiques le rapport TG / HDL-c décèle plus de cas (7 cas) que le rapport HDL-c / Chol T (5 cas). Le rapport LDL-c / HDL-c est celui qui décèle le moins de cas dans le groupe des diabétiques (13 cas). On remarque aussi que le rapport Chol T / HDL-c ne permet pas de déceler efficacement le risque athérogène chez les personnes diabétiques (15 cas). Mais quelque soit le rapport considéré on remarque qu’il y a plus de cas de risque décelés chez les diabétiques que chez les non diabétiques.
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 22 3.2.DISCUSSION
L’objectif de notre étude est de contribuer à la détection et à la prise en charge adéquate des maladies cardio-vasculaires chez les diabétiques. Pour ce faire, le bilan lipidique et le dosage du glucose ont été réalisés chez les sujets diabétiques et non diabétiques de l’Hôpital de Mènontin. L’étude a été faite sur 100 sujets à raison de 60 diabétiques et 40 non diabétiques. La population d’étude compte 55 % de femmes (29% de diabétiques et 26% de non diabétiques) et 45 % d’hommes (31% de diabétiques et 14% de non diabétiques). La remarque est qu’il y a plus de femmes en général que d’hommes dans la population étudiée mais aussi dans le groupe des non diabétiques. Ceci est dû au fait qu’il y a plus de femmes que d’hommes qui fréquentent le Laboratoire de l’Hôpital de Zone de Mènontin. L’âge moyen des sujets diabétiques est significativement différent de celui des sujets non diabétiques. Les sujets diabétiques ont majoritairement plus de 40 ans mais quelques-uns ont moins de 40 ans. Ceci confirme les informations de l’OMS en 2014 où 8,5% de la population adulte (18 ans et plus) était diabétique.
Les différentes paramètres lipidiques qui composent le bilan lipidique étudiés au niveau de chaque catégorie de sujets (sujets diabétiques et sujets non diabétiques) sont : le taux de cholestérol Total, le taux de HDL- cholestérol, le taux de LDL- cholestérol, et le taux des triglycérides. Notre étude a montré que le cholestérol total (p=0,01) est significativement plus élevé chez les diabétiques que chez les non diabétiques au seuil de 5%. Le taux de le HDL-cholestérol (p=0,02) est significativement plus bas chez les diabétiques que chez les non diabétiques. Le taux des triglycérides sont significativement plus élevés chez les hommes diabétiques que chez les non diabétiques au seuil de 5% (p=0,00) de même il est aussi significativement plus élevés chez les femmes diabétiques que chez les non diabétiques au seuil de 5% (p=0,02). Le taux de LDL-c chez les diabétiques n’est pas significativement différent de celui des non diabétiques. La dyslipidémie du diabétique de type II est caractérisée par une augmentation modérée des triglycérides et un abaissement variable du taux de HDL-cholestérol et une accumulation de lipoprotéines résiduelles enrichies en cholestérol, ce qui entraine une élévation du taux de cholestérol total plasmatique (Farnier, 2011). Nos résultats concordent avec ses observations.
diabétiques à l’Hôpital de Mènontin
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 23
A partir des valeurs des différents paramètres lipidiques obtenues et en se référant aux valeurs normales de ces quatre paramètres (Chol T, HDL-c, LDL-c et TG), on a identifié quatre types de dyslipidémies au sein des deux groupes de sujets. On remarque que les cas de dyslipidémies sont plus fréquents chez les diabétiques que chez les non diabétiques. Les diabétiques présentent pour la plupart une hypocholestérolémie HDL, une hypertriglycéridémie et une hypercholestérolémie ; ce qui favorise le risque accru de développement des maladies cardiovasculaires à leur niveau. Ces résultats sont confirmés par les études faites par Tanguy et Aboyans en 2014 qui montrent que les anomalies lipidiques sont fréquentes et particulières chez les patients diabétiques de type II et qu’elles sont définies par des taux élevés de triglycérides et des taux bas d’HDL-c.
Pour déceler un risque athérogène, il est important de calculer les indices d’athérogénicité à partir des résultats obtenus à la fin du bilan lipidique. Ainsi cinq indices ont été étudiés. Il s’agit des indices : Cholestérol Total /HDL-cholestérol ; LDL-cholestérol / HDL-cholestérol ; HDL-cholestérol / LDL-cholestérol ; HDL-cholestérol / Cholestérol T ; Triglycérides / cholestérol. Au cours de notre étude l’indice Triglycérides / HDL-cholestérol a été celui qui caractérise mieux les diabétiques car l’accumulation des triglycérides dans le tissu musculaire est pour la plupart liée à l’insensibilité à l’insuline qui s’observe chez eux (Robert et Grundy, 2006). Combiné au fait qu’ils ont une hypocholestérolémie HDL caractéristique, cet indice reste alors le plus spécifique dans la détection rapide des risques athérogènes chez les diabétiques.
Les résultats auxquels nous sommes parvenus sont préliminaires car notre étude présente plusieurs limites dont la période courte de collecte des échantillons et le manque de contrôle de qualité des paramètres biochimiques sur le semi-automate SECOMAM Basic.
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 24 Notre étude a permis de faire ressortir l’importance du bilan lipidique dans la prévention des maladies cardio-vasculaires chez les diabétiques. La plupart des diabétiques ont des risques athérogènes non signalés. Il a été détecté sur 60 sujets diabétiques 28 cas présentant un risque athérogène élevé. Les cas de dyslipidémies sont plus fréquents chez les diabétiques que chez les non diabétiques et l’indice d’athérogénicité qui permet de mieux déceler le risque athérogène chez les diabétiques est Triglycérides / HDL-cholestérol.
CONCLUSION
diabétiques à l’Hôpital de Mènontin
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 25
Nous suggérons à l’endroit des :
Cliniciens : de toujours demander un bilan lipidique dans la prise en charge des diabétiques.
Biotechnologistes : de toujours veiller au calcul des indices d’athérogénicité car ceci permet de mieux orienter le clinicien dans la prise en charge de ces patients diabétiques.
Autorités de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi : d’approfondir les cours de statistiques aux étudiants en fin de formation.
SUGGESTIONS
Réalisé et soutenu par Camaelle KENOUKON Page 26 Bligny, 2012, Complication du diabète, centre hospitalier de Bligny, p.1, 2
Boumechra H., 2015, Exploration du métabolisme des lipides et lipoprotéines, UNIVERSITE MENTOURI-CONSTANTINE, p7
Daigle, 2006, Les maladies du cœur et les maladies vasculaires cérébrales : prévalence, morbidité et mortalité au Québec. Institut national de santé publique du Québec
Djrolo et al, 2012, prévalence du diabète sucré dans la population adulte à Cotonou bénin, vol 6, numéro 2- P.167-169
Farnier, 2011, Diabète & Obésité, vol 6, numéro 49-p170
Friedewald W.T., Levy R.I., Fredrickson D.S., 1972, Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem.; 18:499-502
Grimaldi A., 2000, Diabétologie
Guerreiro L., 2007, Infirmier DE, synthèse DIABETE
Halitim L., 2014, cours de Biochimie : Les Glucides, UNIVERSITE HADJ LAKHDAR-BATNA, Faculté de Médecine
Ouhoummane N., Émond V., 2005, Hospitalisations et décès après infarctus aigu du myocarde chez les personnes diabétiques : mesures produites dans le cadre du développement du système de surveillance du diabète, Institut national de santé publique du Québec
Organisation mondiale de la santé, 1957, définition Athérosclérose
Organisation mondiale de la santé, 2009, Fiche thématique sur les maladies cardiovasculaires
Organisation mondiale de la santé, 2011, définition Diabète
Organisation mondiale de la santé, 2014, Genève, Rapport mondial sur le diabète
Organisation mondiale de la santé 2015, définition diabète : Diabète, Aide-mémoire, numéro 312
Organisation mondiale de la santé 2015, Programme de l’OMS sur les maladies cardio-vasculaires
Robert E. et Grundy S., 2006, Insensibilité à l’insuline et obésité : la cause sous-jacente, volume 51, numéro spécial
Robert E. et Grundy S., 2006, Insensibilité à l’insuline et obésité : la cause sous-jacente, volume 51, numéro spécial