Quantification des réservoirs

Différentes techniques de quantification du réservoir proviral ont été développées, elles sont basées soit sur des techniques de culture cellulaire, soit sur de la biologie moléculaire (Bruner et al., 2015).

La technique de référence est le qVOA (« quantitative Viral Outgrowth Assay ») qui consiste à mesurer la proportion de provirus qui sont réactivables depuis les lymphocytes T CD4+ latents d’un patient (Chun et al., 1997; Finzi, 1997; Wong, 1997). C’est une technique historique qui consiste à isoler les lymphocytes T CD4+ non activés d’un patient, d’activer ces cellules (par de la PHA ou des anticorps anti-CD3 et anti-CD28) et de co-cultiver les cellules du patient avec des lymphocytes de donneur non infecté. La production de particules virales est ensuite mesurée dans les jours suivants, par mesure de l’antigène p24 ou de l’ARN viral dans le surnageant de la culture cellulaire. Afin de quantifier la proportion de réservoir activable, la technique de dilution limite est utilisée. Les cellules isolées du patient sont diluées à différentes concentrations et le puits avec le moins de cellules dans lequel une production virale est détectée permet de déterminer le titre, exprimé en IUPM (« Infectious Units Per Million »), c’est-à-dire en nombre de lymphocytes T CD4+ réactivables par million de lymphocytes T CD4+ latents. La taille du réservoir réactivable est estimée à environ 1 copie/10⁶ lymphocytes T CD4+ latents chez les patients infectés par le VIH-1 (Finzi, 1997). A ce jour, il n’existe pas de quantification précise du réservoir réactivable chez les personnes infectées par le VIH-2.

52 Cette technique est considérée comme celle de référence car elle ne détecte que les provirus intacts et capables de réplication. De plus, elle peut permettre d’isoler des clones de provirus par séquençage des virus produits aux dilutions limites. Néanmoins, elle possède plusieurs inconvénients. Tout d’abord, elle sous-estimerait le réservoir réactivable car tous les lymphocytes ne seraient pas réactivés après un seul cycle d’activation (Ho et al., 2013). De plus, cette technique est réservée aux laboratoires de recherche spécialisés car elle est complexe et coûteuse (cultures durant 2 à 3 semaines, manipulations à réaliser dans un laboratoire de type P3, nombreuses mesures de quantification de la production virale, volume de sang important requis pour pouvoir tester un nombre suffisant de lymphocytes T CD4+ latents : 120 à 180 mL).

Ces contraintes ont poussé les chercheurs à développer de nombreuses techniques de quantification par biologie moléculaire du réservoir au cours de ces dernières années, qui sont des techniques plus facilement implémentables dans les laboratoires de diagnostic et dans les essais cliniques. Ces techniques amplifient soit les ARN, soit les ADN du VIH présents dans les cellules infectées.

Différentes formes d’ADN du VIH sont présentes dans le noyau des cellules : ADN linéaire intégré, ADN linéaire non intégré, ADN circulaire à 1 ou 2 LTR (Figure 14). Seul l’ADN intégré pouvant mener à la réplication virale, les autres formes sont parfois appelées « dead-end products », c’est-à-dire que ce sont des impasses pour les virus, ne permettant pas la réplication du génome viral. Il est classiquement considéré que les ADN linéaire non intégrés sont la forme la plus abondante, suivie par les ADN intégrés puis les cercles 1-LTR et les cercles 2-LTR. La répartition est toutefois dynamique au cours de la vie cellulaire et/ou des traitements antirétroviraux éventuels (Munir et al., 2013).

53

FIGURE 14 :DIFFERENTS TYPES D’ADN VIRAUX DU VIH.

Représentation des différents types d’ADN du VIH présents dans le noyau d’une cellule infectée. Seule une faible proportion de l’ADN linéaire intégré et intact est réactivable à un moment donné.

Les différentes techniques de PCR utilisées pour quantifier ces différentes formes d’ADN VIH sont les suivantes :

- Quantification de l’ADN total :

Ce fut la première technique de biologie moléculaire développée, elle vise à quantifier tous les ADN du VIH présents dans les CSMP ou les lymphocytes T CD4+ latents. Elle consiste à amplifier une région de l’ADN du VIH sur un extrait d’ADN, par le biais d’une PCR en temps réel ou droplet digital PCR. Les échantillons sont amplifiés en même temps qu’une une gamme (généralement un ADN plasmidique) permettant d’avoir une quantification du nombre de copies d’ADN VIH dans l’échantillon. La région amplifiée est une région hautement conservée du génome rétroviral afin de limiter les mésappariements des amorces et de la sonde. En parallèle de cette PCR, une PCR sur un gène ménager est réalisé (gène de la RNAse P, de l’albumine, etc.) afin de quantifier le nombre de cellules présentes dans l’échantillon de départ. Cela permet de faire un ratio entre ces deux valeurs et d’obtenir la taille du réservoir, exprimé en nombre de copies d’ADN total du VIH par 10⁶ cellules.

Cette technique ne fait pas le distinguo entre les différents types d’ADN viraux mais a l’avantage d’être simple et rapide (moins d’un jour de délai avant le rendu des résultats).

54 De nombreuses études ont analysé le réservoir cellulaire chez les patients infectés par le VIH-1. Il a notamment été démontré que le niveau d’ADN total du VIH-1 était prédictif de l’évolution de la maladie ainsi que du délai avant le rebond de la CV après une interruption des ARV (Rouzioux et al., 2005).

- Quantification de l’ADN linéaire non intégré :

L’ADN linéaire non intégré a une demi-vie très courte dans la cellule infectée, une partie de celui-ci sera intégré dans le génome de la cellule hôte et le reste sera dégradé rapidement. La quantification de l’ADN linéaire non intégré ne présente pas d’intérêt diagnostique aussi aucune PCR n’a été développée pour l’amplifier spécifiquement.

- Quantification de l’ADN intégré (ou Alu-PCR) :

Cette technique se réalise en deux temps. L’ADN extrait des lymphocytes va être amplifié par une première PCR appelée Alu-PCR car l’amorce sens se situe dans la région LTR du VIH et deux amorces anti-sens au niveau d’une séquence répétée « Alu », dans le génome humain. Ces séquences sont répétées dans le génome humain et il est communément admis que les provirus ne sont jamais éloignés de plus de 4000 paires de bases d’une séquence Alu, une distance acceptable pour une amplification par biologie moléculaire. Ainsi, seuls les ADN du VIH intégrés au génome de la cellule hôte vont pouvoir être amplifiés. Des amplicons de taille variable sont donc générés et ces produits de première PCR vont être amplifiés par une PCR nichée en temps réel, avec une amorce sens correspondant à lambda-T, tandis que la sonde et l’amorce anti-sens sont complémentaires de la région LTR du VIH. Cette deuxième PCR spécifique du VIH présente deux avantages : 1) elle permet d’amplifier le signal et de quantifier par PCR en temps réel le nombre de copies d’ADN VIH intégré, 2) elle ne détecte que les ADN intégrés car du fait de l’utilisation de la séquence lambda T, les ADN non intégrés ne pourront pas être amplifiés durant la PCR en temps réel car n’ayant pas été amplifiés durant la première PCR, l’amorce correspondant à la séquence lambda T ne se fixera pas et 2) elle peut également permettre d’obtenir des informations sur les sites d’intégration du virus, par séquençage haut débit des produits de PCR nichée.

- Quantification des ADN circulaires à 1 ou 2-LTR :

Il s’agit de deux ADN dits épisomaux, qui sont principalement retrouvés dans les cellules nouvellement infectées (Butler et al., 2001). Ces deux types d’ADN sont rarement quantifiés, en dehors de certains travaux de recherche.

55 La PCR de l’ADN circulaire à 2-LTR peut être utilisée comme un marqueur d’infection récente mais également sur les cellules traitées par un inhibiteur d’intégrase car les molécules de cette classe tendraient à augmenter la proportion de cercles 2-LTR dans le noyau (Thierry et al., 2015). La PCR utilise alors une amorce anti-sens dans la région U3 du LTR, une amorce sens dans la région U5 du LTR et une sonde chevauchant la jonction U5-U3. Cette PCR ne peut amplifier que les cercles à 2-LTR qui présente deux régions LTR collées et donc les régions suivantes : U3-R-U5-U3-R-U5 alors que les autres ADN n’ont pas cette jonction U5-U3.

Toutes ces techniques ont en commun de surestimer le réel réservoir du VIH réactivable puisqu’elles peuvent amplifier des provirus dits défectifs, c’est-à-dire non capables de se répliquer, car porteurs de mutations G vers A, de larges déletions dans le génome, des « indels » (des petites insertions ou délétions) ou des délétions dans le signal de « packaging » (Figures 15 et 16).

Récemment de nouvelles techniques de quantification du réservoir latent ont été décrites. Ces techniques se basent sur le séquençage complet, ou quasi-complet, du provirus (Bruner et al., 2016; Hiener et al., 2017). Des dilutions limites des échantillons sont réalisées avant amplification par PCR pour n’amplifier qu’un génome proviral par réaction de PCR. De nombreuses réactions de PCR sont réalisées en parallèle afin d’amplifier les différents provirus présents dans l’échantillon de départ. Les produits de PCR sont ensuite séquencés par une technologie de séquençage haut débit et les séquences obtenues sont analysées pour identifier les provirus intacts et les provirus défectifs, et leur proportion respective (Bruner et al., 2019) (Figure 15).

56

FIGURE 15 :REPARTITION DES PROVIRUS DU VIH-1

Les provirus du VIH-1 amplifiés à partir des lymphocytes de patients sont majoritairement défectifs, du fait de délétions internes et/ou d’hypermutations G vers A induites par les protéines cellulaires APOBEC3GF. D’autres formes de provirus défectifs sont décrites, des délétions dans le signal de packaging ψ et l’introduction de codons stop précoces dans les régions codantes. (Figure adaptée de Bruner et al., 2019)

Pour quantifier les réservoirs latents dans le VIH-2, seule la PCR de l’ADN total du VIH-2 est utilisée, les autres techniques n’ayant pas encore été développées (Bertine et al., 2017). Notre connaissance du réservoir latent du VIH-2 est principalement limitée au réservoir viral dans les CSMP, peu de prélèvements profonds ayant été analysés. La taille de ce réservoir serait réduite chez les PVVIH-2 par rapport aux PVVIH-1 mais la différence n’est pas retrouvée dans d’autres études, notamment quand les PVVIH-1 et PVVIH-2 sont appariés par le taux de CD4, leur âge et la durée d’infection (Gottlieb et al., 2008a; Gueudin et al., 2008).

57 Une étude a rapporté les sites d’intégration du VIH-2 dans le génome humain mais cela n’a été fait que sur des cellules infectées in vitro par une seule souche de VIH-2 (MacNeil et al., 2006). Une autre étude de la même équipe a montré que le pourcentage d’ADN intégré ne différait pas entre les PVVIH-1 et les PVVIH-2, mais que la quantité d’ARN messagers LTR-Gag était plus faible chez les PVVIH-2 (MacNeil et al., 2007).

Enfin, certaines équipes utilisent des mesures des ARN viraux pour estimer le réservoir viral activé à un moment M. Ces PCR vont amplifier soit l’ARN plasmatique par des techniques ultrasensibles, soit les ARN messagers associés aux cellules, aussi appelés « transcrits viraux », qu’ils soient peu, multi- ou non épissés (Pasternak et al., 2013).

Ces techniques de RT-PCR ont été appliqués à la fois aux techniques de culture (VOA), afin de détecter plus précocement les puits dans lesquels il y a une production virale, et ont également été utilisés pour détecter ces transcrits viraux dans les cellules des patients.

FIGURE 16 :COMPARAISON DES TECHNIQUES DE QUANTIFICATION DU RESERVOIR LATENT

DU VIH-1

Le réservoir latent a été quantifié par différentes techniques au sein d’une cohorte de 20 patients traités par ARV au stade chronique de l’infection et de 10 patients traités au stade précoce. La virémie de ces patients était indétectable depuis 8 et 6 ans, en médiane, respectivement. (Figure reproduite d’Eriksson et al., 2013)

58