IV.2 Montage expérimental
IV.2.4 Protocole expérimental
IV.2.4.4 Quantification de la densité de protéines dans des GUVs
Après la reconstitution des protéines dans des GUVs, on souhaitait pouvoir quantifier directement la densité de protéines dans chaque GUV. En effet, il existe en général une certaine dispersion sur la quantité de protéines reconstituées par GUV (Cf. par exemple (Aimon et al. 2014)). Pour cela, on peut marquer les protéines avec des marqueurs fluorescents; en effet le groupe de P. Bassereau a développé une méthode permettant de mesurer la densité des protéines dans des GUVs en mesurant leurs intensités de fluorescences (Aimon et al. 2014).
Au début de ma thèse nous disposions de protéo-SUVs d'AQP0 marquées avec de l’Alexa 488 maléimide (Invitrogen). Ce marqueur fluorescent présente un maximum d’absorption à 495 nm et un maximum d’émission dans le vert à 519 nm. J’ai tout d’abord préparé des GUVs contenant AQP0 marquée à l’Alexa. Ensuite je les ai marqués avec les QD655 dont les longueurs d’onde d’excitation et d’émission ont été mentionnées dans la section IV.2.1. Le problème que j’avais rencontré est que quand j’excitais les GUVs avec la lumière bleue de l’épifluorescence à 435 nm, j’excitais à la fois les QDs mais aussi les Alexa et j’avais une image très saturée (voir Figure 74) et je ne pouvais donc pas observer les QDs isolement. Pour cela nous avons choisi de ne pas utiliser l’Alexa 488. Nous avons donc continué ce travail en utilisant des AQP0s non marquées en fluorescence puis la BR pour les raisons de GUVs « éponges » mentionnées dans la IV.2.4.2.
Figure 74 : Image en épifluorescence via la caméra EMCCD Andor d’une vésicule contenant l’AQP0 marquée avec de l’Alexa 488 (marqueur vert) et avec des nanoparticules fluorescentes (QD655). La longueur d’onde d’excitation et d’émission sont respectivement 435 ± 40 nm et 655 ± 15 nm. La barre d’échelle est de 4 µm.
La BR a un spectre d'absorption large dans le visible (Cf Figure 45) avec un maximum dans le vert à 568 nm. Elle absorbe la lumière à partir de 480 nm environ et au-delà de 600 nm. Il est donc difficile de trouver un marqueur fluorescent qui soit excité hors de la gamme d'activation de la BR. Afin de ne pas activer la BR, nous avons donc choisi de ne pas marquer du tout la protéine avec des marqueurs fluorescents.
En d’autre terme, dans ce projet nous n’avons pas quantifié directement la densité des protéines (Ф) dans les GUVs. Nous avons supposé que la densité initiale de protéines incorporée dans les protéoliposomes reste la même dans les GUVs obtenues après électroformation. La question maintenant est de savoir quelle erreur je fais sur mon estimation de la fraction surfacique Ф.
Erreur sur l'estimation de Ф
Dans cette section, je vais présenter les erreurs que l’on peut estimer sur la densité de protéine dans mes vésicules. Je vais pour cela discuter les résultats obtenus dans l’équipe sur deux autres types de protéines membranaires : KvAP (canal K+ voltage-dependent) et AQP0. Aimon et al. ont montré qu’on pouvait quantifier la densité de protéines membranaires incorporées dans des GUVs en mesurant leurs intensités de fluorescences en microscopie confocale, à condition de connaître le taux de marquage des protéines (Aimon 2011). Ils avaient reconstitué le canal potassique KvAP. La Figure 75 issue de (Aimon 2011) montre un histogramme de densité de protéines de 72 GUVs préparées dans un tampon de faible taux de salinité à partir de SUVs contenant 1600 ± 400 KvAP / μm2, mesurée par spectroscopie d’absorption. La distribution est assez large, mais la densité moyenne des protéines dans les GUVs est de 1000 ± 700 protéines/μm2, donc inférieure à la densité des SUVs à partir desquelles elles ont été préparées. Donc, en supposant que les densités des GUVs et des SUVs sont identiques, on commet une erreur relative de 37.5%.
Figure 75 : Histogramme de densité de KvAPs dans des GUVs. Les GUVs ont été préparées en utilisant un tampon salin (5 mM KCl, 1 mM HEPES, 400 mM sucrose) et la densité des protéines est mesurée par microscopie confocale. La densité moyenne des protéines dans les GUVs (1000 ±700 protéines / μm2) est comparable mais cependant inférieure à la densité de protéines dans les SUVs (EPC: EPA) à partir desquelles elles ont été formées (1600 ± 400 protéines / μm2)(Aimon 2011).
De la même façon que précédemment, Berthaud et al. ont quantifié la densité d'AQP0 reconstituée dans des GUVs (Berthaud et al. 2016). Avec une densité initiale dans des SUVs de 1600 AQP0/μm2
est de 1000 ± 400 AQP0 /μm2. Donc, il y a une différence relative de 37% entre la densité moyenne dans les GUVS et les SUVs.
Figure 76 : Histogramme de densité d'AQP0s reconstituées dans des GUVs. La densité des protéines est mesurée par fluorescence confocale quantitative. La densité moyenne des protéines dans des GUVs (1000 ±400 protéines / μm2) est comparable à la densité des protéines dans des SUVs (EPC: EPA) à partir desquels ils ont été formés (1600 ± 350 protéines / μm2) (Berthaud et al. 2016).
Ces deux études montrent que l'erreur que l'on commet en supposant que la densité de protéines dans les GUVs est identique à celle des SUVs dont elles sont issues est faible, de l'ordre de 40% environ. Dans mes expériences, je n’ai pas pu quantifier la densité de BR dans les GUVs pour les raisons énoncées plus haut et j'ai donc supposé qu'elle était égale à celle des SUVs. Néanmoins, j'estime donc que l'erreur que je commets sur la fraction surfacique Ф est raisonnable, compte tenu de la large gamme de densités explorées.
V Résultats
Dans ce chapitre, je vais présenter les résultats de mes travaux. Tout d'abord, je présenterai des expériences de contrôle réalisées en l’absence des protéines. Ces expériences ont pour but de fournir une valeur de référence pour la diffusion des lipides dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) à géométrie quasi-plane ne contenant pas des protéines. Dans un second temps, je présenterai les résultats sur l’effet de la densité de BR sur la diffusion des lipides dans des GUVs, dans la même géométrie. Enfin, je finirai avec les mesures de l’effet de la densité de BR sur sa propre diffusion.