Partie 1 : Rôle des extractibles
B. Etude métabolomique par une approche ciblée
II. Quantification de potentiels biomarqueurs : les phénols totaux
1. Généralités sur les méthodes d’extractions des composés phénoliques
La notion de composés phénoliques fait référence à des métabolites regroupés en fonction de leur origine biosynthétique, généralement ceux issus de la voie du shikimate et de l’acétyl-CoA (Bruneton, 2016). Ces composés englobent une pluralité de familles chimiques (les flavonoïdes, les tanins, etc) et sont généralement solubles dans les solvants polaires tels que l’eau, (chauffée ou non), l’éthanol ou le méthanol. Ils ont aussi la particularité d’être antioxydants. En effet, les composés phénoliques sont capables de retarder significativement ou de prévenir l’oxydation de lipides, de protéines ou de glucides provoquée par la production de radicaux oxygénés libres ou ROS (Reactive Oxygen Species), à l’origine d’importants dégâts cellulaires. Ces dégâts cellulaires sont induits par les champignons lignivores, par exemple, au cours de la dégradation du bois. De manière in vitro, l’évaluation de l’activité antioxydante peut se fait par le biais de méthodes antiradicalaires qui reposent sur la capacité de piégeage de radicaux libres tels que les ROS par des antioxydants. Par conséquent, cette activité antiradicalaire est un facteur de résistance biologique face à la dégradation du bois par le champignon lignivore. Dans le cas de cette thèse, les teneurs en composés phénoliques totaux du bois de 15 individus échantillonnés ont été déterminées puis leurs activités antiradicalaire ont été évaluées.
2. Extraction des polyphénols totaux
L’extraction des polyphénols totaux a été réalisée à partir du duramen externe des 15 individus de l’échantillonnage, en 3 exemplaires analytiques. Un total de 45 extraits a ainsi été obtenu. Cette extraction s’est déroulée à partir de 50 mg de poudre de bois (granulométrie de 200 µm), en présence de 1,8 mL d’une solution préparée avec 800 mL de méthanol et 200 mL d’eau milliQ dans laquelle 25,2 mg de 6 méthoxyflavone ont été dissous (témoin interne en cas de quantification en HPLC-DAD). L’extraction a été réalisée selon le protocole de Boizot and Charpentier (2006). Tous les extraits sont conservés dans de l’eau ultra pure, à 4°C en vue de la quantification des polyphénols totaux.
3. Dosage des composé phénoliques totaux
Le dosage des composés phénoliques a été effectué selon le protocole de Boizot and Charpentier (2006) par le réactif de Folin Ciocalteu, en présence d’une solution de carbonate de sodium (Na2CO3) à 75 g.L-1 et des extraits en polyphénols totaux préparés à l’étape précédente. Le principe de la réaction repose sur la réduction des acides phosphotungstique et phosphomolydbique de couleurs jaunes, composant le réactif de Folin Ciocalteu, en tungstène et molybdène de couleurs bleu en présence de composés phénoliques. L’acide gallique a été
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utilisé pour établir la courbe de calibration (Figure 32) constituée de 8 points de gammes : 0 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL, 4 µg/mL, 8 µg/mL, 12 µg/mL, 15 µg/mL et 20 µg/mL. Toutes les absorbances ont été mesurées à 735 nm, à partir du lecteur de microplaques SAFAS Xenius XML (SAFAS Monaco).
4. Mesure de l’activité antiradicalaire des extraits en composés phénoliques totaux
Les composés phénoliques sont connus pour leur capacité à piéger les radicaux libres et donc pour leur activité antioxydante (Bruneton 2016). Cette activité est liée à la présence des groupements hydroxyles présents sur les composés polyphénoliques. Elle peut être mesurée en utilisant la méthode TEAC (Trolox Equivalent Antioxydant Capacity) avec le radical libre DPPH• (2,2 diphenyl-1-picryl hydrazyl) Figure 33), qui possède un électron non apparié sur l’atome d’azote au niveau du pont. La méthode au radical libre DPPH• est simple, stable et reproductible. Son principe repose sur la réduction du radical DPPH• de couleur violette, en présence de composés capables piéger les radicaux libres (R) tels que les polyphénols (ArOH) (Brand-Williams et al. 1995; Prior et al. 2005). La réaction de réduction s’accompagne d’une perte de couleur du radical libre DPPH• associée à une diminution de son absorbance. En effet, la quantité de DPPH restant dans le milieu réactionnel est proportionnelle à la concentration de composés capables de piéger les radicaux libres. La réduction du radical libre DPPH• repose sur deux mécanismes : par transfert d’hydrogène du composé piégeur de radicaux libres (ici,
y = 0,0985x R² = 0,9803 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 0 5 10 15 20 25 Ab so rb an ce à 735 n m
Concentration en équivalent d'acide gallique (EAG) en µg/mL
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les polyphénols) ou alors par transfert d’électron (Prior et al. 2005).
La méthode est standardisée par rapport au Trolox (acide 6-hydroxy-2, 5, 7, 8 tétraméthylchroman-2-carboxylique) qui est capable de réduire le radical libre DPPH•. Cette méthode permet de déterminer la réduction relative du DPPH• en pourcentage d’inhibition. Le trolox, utilisé comme standard, est un analogue de la vitamine E (Figure 34).
L’activité antiradicalaire des composés phénoliques totaux, présents dans les extraits de duramen externe des 15 individus échantillonnés, a été mesurée en présence du radical libre DPPH• de couleur violette. Une solution mère de Trolox à la concentration de 10 mM a été utilisée pour la réalisation des points de gamme dans le méthanol, à savoir 320 µM, 640 µM, 960 µM, 1280 µM et 1600 µM. La courbe d’étalonnage réalisée est présentée en Figure 35. La mesure de l’activité antiradicalaire a été adaptée selon la méthode décrite par Kordali et al. (2005).
Figure 34: Structure moléculaire du Trolox Figure 33: structure moléculaire du radical libre DPPH•
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Figure 35: Courbe de d’étalonnage du Trolox à 515 nm
Tous les extraits ont été dilués au 1/8e dans le méthanol qualité HPLC. Un volume de 3,9 mL d’une solution de DPPH à 0,1 mM additionnés de 0,1mL de l’extrait ou de la solution de Trolox sont d’abord agités au vortex (au moins 5 secondes) puis introduits dans des cuves. Le temps d’incubation est de 2 h à l’obscurité avant analyse. Les absorbances ont été mesurées à 515 nm, à l’aide d’un spectrophotomètre Varian Cary® 50 UV-Visible (Agilent).
Les résultats sont exprimés en pourcentage de l’inhibition des radicaux libres en utilisant l’Équation 6 suivante :
% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛 = (𝐴−𝐵
𝐴 ) ∗ 100
Équation 6: Calcul du pourcentage d'inhibition des extraits en composés phénoliques totaux ; A : absorbance du contrôle négatif et B : absorbance de l’extrait ou du Trolox
Ce pourcentage d’inhibition montre la capacité de l’extrait à une concentration donné de réduire ou non le DPPH•.