I. Dosages de macromolécules
Le dosage des macromolécules (lignines, cellulose et hémicelluloses) et des extractibles totaux a été réalisé par l’équipe d’Anne Clément Vidal, de l’Unité Mixte de Recherche Amélioration Génétique et Adaptation des plantes Méditerranéennes et Tropicales (AGAP) du Cirad. Tous les dosages ont été réalisés à partir du duramen externe (granulométrie de 200 µm) provenant des 15 individus de l’échantillonnage. Une étape préliminaire d’extraction des métabolites totaux présents dans la poudre de bois a été réalisée en amont du dosage des macromolécules. En effet, les extractibles peuvent induire un biais de mesure dans la quantification des macromolécules.
1. Dosage des extractibles totaux
Les extractibles du duramen externe ont été extraits à l’aide du Soxtec™ qui est un système d’extraction par solvant semi-automatisée. Quelques modifications ont été apportées sur ce système d’extraction. Des ballons de 2 L faits sur mesure ainsi que des chauffe-ballons adéquats et des colonnes réfrigérantes ont été adaptés sur cet appareil. Des cartouches de cellulose ont été utilisées pour l’extraction, dans lesquelles 2,5 g de poudre de bois (200 µm) ont été déposés. La poudre de bois a été séchée au préalable à l’étuve à 105°C pendant 2 h avant extraction. Dans les ballons de 2 L, un volume de 250 mL du solvant d’extraction a été introduit. Deux types d’extractions ont été effectués, avec une extraction par immersion de la poudre de bois (contenue dans la cartouche) dans le ballon une fois le solvant à ébullition, durant 30 min. La seconde extraction s’est déroulée par entrainement à la vapeur des extractibles, en disposant la cartouche à 1 cm dessus du solvant pendant une heure. La cartouche a été suspendue au-dessus du solvant à l’aide d’un fil. L’eau milliQ puis l’éthanol 95° ont été utilisés comme solvants d’extraction aux températures d’ébullition respectives de 100°C et 70°C. L’extrait récupéré dans le ballon a été concentré et séché à l’évaporateur rotatif et à l’étuve à 105°C pendant 2 h. Un seul extrait en extractibles totaux a été préparé par individu. De même, un seul dosage a été effectué par individu échantillonné (hormis l’individu A4) pour l’extrait total. Les résultats des dosages sont exprimés en pourcentage d’extraits par rapport à la masse sèche de la poudre de bois.
La poudre de bois extraite sera utilisée pour le dosage des lignines, de l’holocellulose (cellulose et hémicelluloses) ainsi que l’α-cellulose (phase insoluble de la cellulose). Un seul dosage a été effectué par individu de l’échantillonnage (hormis l’individu A4) et par type d’analyse, à savoir la mesure de la lignine, de l’holocellulose et de l’α-cellulose.
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2. Dosage de la lignine Klason et de la lignine acide-soluble
Avant dosage de la lignine, la poudre de bois dépourvue de ses extractibles a été séchée à l’étuve à 105°C pendant 2 h. Le dosage de la lignine a été réalisé en milieu acide. La méthode de dosage se base sur l’insolubilité de la lignine dans un milieu acide concentré alors que les autres constituants pariétaux (cellulose et hémicelluloses) sont hydrolysés et dissous. Cette lignine insoluble, qui peut être estimée par méthodes gravimétriques, est aussi connue sous le nom de lignine Klason. Une petite partie de la lignine reste cependant soluble dans les acides ou lignine acide-soluble. Plusieurs étapes sont nécessaires pour permettre leur estimation dans le bois (Giger 1985; Monties 1984).
L’étape d’hydrolyse principale consiste à mettre en contact 5 mL d’acide sulfurique concentré à 72 % avec 360 mg de poudre de bois sèche puis de placer le mélange au bain marie à 20°C pendant 2 h. Le mélange est agité toutes les 10 minutes. Une étape de post hydrolyse a été réalisée, avec ajout de l’eau distillée jusqu’à obtenir une concentration en acide de 3% dans le mélange. Cette étape a pour but de favoriser la précipitation de la lignine acide-soluble. Le mélange a ensuite été placé à l’autoclave à 121°C pendant une heure pour permettre un lavage en profondeur du résidu. Afin de récupérer la lignine Klason, le mélange a d’abord été filtré sous vide et la lignine déposée sur le papier filtre a été séchée à l’étuve pendant 2 h à 105°C. Les résultats des dosages sont exprimés en pourcentage de lignine Klason en fonction de la masse sèche de la poudre de bois.
Le filtrat liquide, contenant la lignine acide-soluble a été conservé pour effectuer le dosage du composé au spectromètre UV.
3. Dosage de l’holocellulose
La méthode utilisée pour le dosage de l’holocellulose est celle décrite par Browing (1977) avec quelques modifications. Le dosage consiste à mettre en contact 1 g de la poudre de bois dépourvue d’extractibles avec 80 mL d’une solution tampon acétate de sodium (environ 6,2 g de NaOH, 17,8 mL d’acide acétique glaciale qsp 250 mL d’eau distillée) et 2 mL d’une solution de chlorite de sodium à 27 %. Le mélange précédemment formé est placé au bain marie à 76°C pendant 1 h, avec une agitation manuelle fréquente. Un volume de 2 mL de solution de chlorite de sodium à 27 % est ajouté à chaque heure dans le mélange maintenu au bain-marie. Au total, 6 mL sont rajoutés dans le mélange.
La solution de chlorite a été utilisée pour la délignification sélective du bois, avec la lignine qui se retrouve en solution. L’holocellulose, résidu solide, est constituée de cellulose et
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d’hémicelluloses. Pour récupérer l’holocéllulose, le mélange a été filtré puis rincé avec 300 mL d’eau distillée et 15 mL d’acétone pour obtenir une décoloration. Enfin, elle a été séchée à l’étuve pendant 2 h à 105 °C. Après avoir déterminé les teneurs en holocellulose, cette dernière a été conservée pour le dosage de l’α-cellulose. Les résultats des dosages sont exprimés en pourcentage d’holocellulose par rapport à la masse sèche de la poudre de bois
4. Dosage de l’α-cellulose
L’α-cellulose a été obtenue à partir de l’holocellulose. Elle représente la phase insoluble de la cellulose en milieu alcalin. Pour ce dosage, toutes les étapes ont été réalisées au bain-marie à 20°C. La première étape a consisté à l’imbibition de 800 mg d’holocellulose avec 5 mL d’une solution de NaOH à 17,5 %. Puis, de petits volumes de la solution de NaOH (2,5 mL) ont été rajoutés régulièrement au mélange précédemment formé accompagnés d’une agitation manuelle de 5 min. Enfin, pour récupérer l’α-cellulose, le mélange obtenu précédemment a été filtré en présence de 50 mL d’une solution de NaOH à 8,3 %. L’α-cellulose déposée sur le filtre a été rincée deux fois à l’eau distillée.
Afin de neutraliser la soude encore présente dans l’α-cellulose, cette dernière a été rincée avec 7,5 mL d’acide acétique à 10 %. L’α-cellulose a aussi été rincée avec de l’eau milliQ jusqu’à l’obtention d’une couleur blanche. Enfin, elle a été séchée à l’étuve à 105°C pendant 2 h afin de déterminer sa teneur dans le bois. Les résultats des dosages sont exprimés en pourcentage de l’α-cellulose par rapport à la masse sèche de la poudre de bois.
II. Mesure de l’infradensité
La densité du bois est définie par sa masse volumique (rapport entre la masse du bois et son volume) à une humidité donnée du bois. Les méthodes de mesure de densité sont directes, par mesure de la masse et du volume, par déplacement d’eau ou des dimensions des éprouvettes selon les trois plans (longueur, largeur et épaisseur) (Rajemison 2013). Le bois étant un matériau hygroscopique, la densité peut être mesurée pour différents états d’humidité des éprouvettes d’essais, par exemple, à 12% d’humidité, à l’état vert ou encore à l’état anhydre. Il existe une mesure particulière de la densité, à savoir l’infradensité qui est le rapport de la masse anhydre du bois sur un volume saturé en eau.
Dans le cas de cette thèse, la mesure d’infradensité a été réalisée afin d’évaluer son influence dans la résistance biologique à l’égard des champignons lignivores. Elle intègre de nombreuses propriétés du bois et permet une bonne estimation de la masse de la matière lignocellulosique (Chave et al. 2009). La mesure de l’infradensité a été réalisée avec précision par la méthode
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du déplacement de la masse d’eau comme décrite par Williamson and Wiemann (2010). Cette méthode nécessite une immersion dans l’eau des éprouvettes de bois de petites dimensions dans un système sous vide. Idéalement, les éprouvettes sont mesurées à l’état vert (Mv), dans un délai maximal de 24 h après abattage. Dans le cas de cette thèse, les éprouvettes ont d’abord été immergées pendant 10 jours dans un dispositif sous vide, afin de les saturer en humidité puis leurs masses saturées ont été mesurées (Ms). La masse d’eau déplacée par l’éprouvette saturée en eau est ensuite mesurée (Mi) à l’aide d’une balance équipée d’un kit de détermination de densité (Sartorius YDK). Les éprouvettes sont ensuite séchées à l’étuve pendant 48 h à 103°C, et les pesées sont réalisées à l’issue de cette durée, ceci afin de déterminer la masse anhydre (MO). Les mesures ont été effectuées à partir du duramen externe des 15 individus de l’échantillonnage, avec une éprouvette par individu.
Toutes ces mesures donnent accès à l’infradensité par l’Équation 10 suivante :
𝐼𝑛𝑓𝑟𝑎𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡é (𝐼𝐷) = 𝑀0 𝑀𝑠 − 𝑀𝑖=
𝑀0 𝑉𝑠
Équation 10: Calcul de l'infradensité
Avec M0 : Masse anhydre, Ms : Masse saturée, Mi : Masse immergée et Vs : Volume saturé de l’éprouvette.
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