Quantification de la biomasse du mildiou - Analyse intégrée de la réponse de la vigne à l'infec

2. Méthodes

2.2 Quantification de la biomasse du mildiou

2.2.1 Matériel

La quantification de la biomasse de mildiou a été effectuée sur trois feuilles infectées par l’isolat Colmar et trois feuilles non-infectées des variétés Bianca, Syrah et Riparia. 4 disques ont été prélevés avant inoculation pour etre analysé par LC-MS et qPCR. Les feuilles ont ensuite été prélevées à 24, 48, et 72 hpi. 5 disques ont été prélevés par temps de cinétiques : 2 pour suivre l’infection en microscope à epi-fluorescence, deux disques poolés pour l’analyse qPCR, et enfin un disque pour analyse en LC-MS. Enfin, un disque a été prélevé par feuille à 6 jpi pour quantifier la sporulation du mildiou.

2.2.2 Estimation de la concentration des suspensions de sporanges

La quantification de la sporulation de P. viticola en fin de cycle infectieux et l’estimation de la concentration des inocula ont été effectuées à l’aide d’une lame de Malassez. La totalité de la cellule de Malassez est composée de 100 rectangles. Le volume total de la cellule est de1 mm³. Les sporanges sont comptés dans 10 rectangles non-contigus pris au hasard sur la cellule. Le volume d’un rectangle étant de 0,01 µL. Il suffit ensuite de multiplier le résultat par 10 000 pour obtenir le nombre de cellule par mL. Les sporanges sont détachés par lavage des feuilles dans 1,5 mL d’eau stérile. Les glissières latérales de la lame son humidifiées avant d’y déposer la lamelle. L’extrémité de la pipette est placée contre la lamelle, et la solution à quantifier est délivrée par capillarité. Les spores sont comptées sous la loupe binoculaire.

2.2.3 Quantification du mildiou par analyse qPCR

2.2.3.1 Extraction de l’ADN de feuilles de vignes et de suspension de sporanges

L’ADN de disques foliaires prélevés sur des variétés Syrah, Bianca et V. riparia ont été extraits à l’aide du Kit d’extraction Qiagen DNeasy® Plant Mini Kit. Les disques foliaires ont été broyés dans l’azote liquide pendant 30 secondes à 30Hz. Du PVP a été ajouté au tampon de d’extraction fourni avec le kit (10mg de PVP30 par échantillon) : le PVP absorbe particulièrement bien les polyphénols et permet donc d’obtenir en fin d’extraction des ADN présentant une bonne pureté avec de meilleurs rendements. Pour l'extraction d'ADN de P.

viticola, une suspensions de sporanges a été centrifugée à 13500g pendant 20 minutes, le

surnageant a été retiré, et l’ADN du culot obtenu a été extrait à l’aide du Kit d’extraction Qiagen DNeasy® Plant Mini Kit.

2.2.3.2 Dessin des amorces qPCR spécifiques à P. viticola et V. vinifera

Les amorces ont été conçues en utilisant le logiciel Beacon designer. Les données de séquences de V. vinifera ont été obtenues sur le site genoscope. Les séquences de P. viticola

ont été obtenues auprès de Pere Mestre (INRA, Colmar).

Gène Amorce Amorce sens Amorce antisens

Actine Actin-P.viticola ACTTCTTTTCCGCCTCTTCCT CCCGACGATCGAGGGAAAC

Facteur d’initiation

de traduction ^IF2/IF5-^P.viticola ^{GTCGGAGAGTCACTTAGCGT} ^{TACTTGGCCACCTGGTTGTTC}

Facteur d’initiation

de traduction ^eIF1a-^{P .viticola} ^{GCCCTTGACAACTTGAACGC} ^{GTGGTAACCATACCGGGCTT}

Cytochrome B CytoB-P.viticola TGATGGCGACTGCATTTATGG TCAACGGCGAATCCACCC

Cyclo-oxygenase Cox2-P.viticola TGGTTCCGGAAAGTGATTTAGCA TTCCCAATGAAGGTATCGCCC

Actine Actin-V. vinifera CCAGAAGTCCTCTTCCAGCC GGTTGACCCACCACTAAGCA

Facteur d’initiation

de traduction ^EiF4G-^{V. vinifera} ^{TGTGTTGAGGAGCTGAAATC} ^{AAATCCCTAGCAGCAAAAC}

Facteur d’initiation

2.2.3.3 Amplification PCR

Les amorces produites ont été testées en PCR sur une extraction d’ADN de sporanges, de feuilles non infectés et de feuilles infectées. La réaction PCR se déroule dans le milieu réactionnel suivant :

Milieu réactionnel concentration

Taq polymérase (Taq Core Kit, MP Biomedicals) Tampon PCR 1 X dNTP Primer sens Primer anti-sens Matrice : H2O qsp 20 µl 1,5U 1 200 µM 0,5 mM 0,5 mM 10ng.µl^-1

Les conditions d’amplification utilisées sont les suivantes :

Les amplicons sont ensuite envoyés pour séquençage (Genoscreen).

2.2.3.4 PCR quantitative

La PCR en temps réel repose sur la détection de la fluorescence émise par un fluorophore lié à l’ADN, au cours de chaque cycle d’amplification. Le fluorophore utilisé est le SybrGreen, capable de se lier à l’ADN et d’émettre une fluorescence uniquement lorsqu’il est intégré dans l’ADN double brin de façon aspécifique. Au cours de la phase exponentielle de la PCR, la fluorescence sera directement proportionnelle à la quantité d’amplicons formés, mais aussi à la quantité de matrice initiale. Le système optique couplé au thermocycleur iCycler System (Biorad) permet de détecter à chaque cycle d’amplification la fluorescence du SybrGreen. Les données de fluorescence sont transmises au logiciel MyIQ (Biorad) qui détermine un cycle «

Phase du cycle PCR durée température

Dénaturation 2 minutes 94°C

Dénaturation 30 secondes 94°C

Hybridation 30 secondes 60°C

Elongation 45 secondes 72°C

seuil », Cq, pour lequel le signal fluorescent émis est supérieur au bruit de fond. Le Ct sera donc d’autant plus faible que la quantité de matrice cible initiale sera élevée.

Dans chaque puit ont été déposés 2,5 µL d’ADN dilués à 10ng / µL, 12,5 µl de SybrGreen Supermix (Biorad) et 200 nM de chaque amorce, pour un volume final de 20 µl. Chaque réaction a été réalisée en duplicat. Pour chaque plaque, un témoin sans matrice a été déposé.

Pour établir la gamme étalon de chaque fragment cible, celui-ci a été amplifié par PCR puis dosé par spectrophotométrie (Nanodrop). Le nombre de chaque nucléotide a permis d’établir la masse molaire de l’amplicon ainsi que la concentration de l’amplicon en nombre de copies / µL. La gamme étalon a enfin été ajustée par dilution en cascade au 1/10^ème pour déposer de 10⁸ à 10² copies. La pente de la droite établie grâce à la gamme étalon a permis de vérifier l’efficacité de la PCR : Efficacité (E) = 10-1/pente.

Le programme du thermocycleur est le suivant :

Phase du cycle qpcr Durée Température

Dénaturation initiale 30 secondes 95 °C

Dénaturation 5 secondes 95 °C

Hybridation 60 secondes 60 °C

Elongation 77 secondes 77 °C

Acquisition

de la fluorescence ^{10 secondes} ^{77 °C}

Courbe de fusion pas de 0,5 °C toutes les 5secondes 55 °C à 95 °C

L’expression de chaque gène d’intérêt (gene of interest: GOI) a été normalisée par rapport au gène codant pour le facteur d’initiation de la traduction de vigne (eIF4G). Le taux d’expression relatif de chaque GOI a été calculé entre les conditions inoculées et les plantes au temps 0 de l’expérience. Le calcul tient compte de l’efficacité (E) de PCR qui peut varier d’un gène à l’autre.

Où E : Efficacité de la PCR ; ΔCq : Différence entre le cycle seuil pour la condition témoin (ex : eau) et le cycle seuil pour l’autre condition (ex : inoculé).

Dans le document Analyse intégrée de la réponse de la vigne à l'infection par Plasmopara viticola : par l'étude d'un cas de contournement de résistance (Page 81-85)