Analyse non-ciblée

En complément des résultats obtenus à partir de l’analyse ciblée, le métabolome de Bianca a été analysé lors de l’interaction compatible et incompatible avec P. viticola de manière non-ciblée. L’analyse non-ciblée permet de sélectionner des métabolites de manière

Figx;: intensité de détection des phytohormes acide salycilique et jasmonique au cours de l’infection de P. viticola.

Les conditions observées sont en abscisse. Les ordonnées sont en intensité (unité abstraite).

NI: non-inoculé; Col: inoculation Colmar; Led:inoculation Lednice; hpi: inoculation –post-inoculation.

En bleu, les échantillons non-inoculés; en vert les échantillons infectés par Colmar; en violet, les echantillons infectés par Lednice

trans-resvératrol! cis-picéide!

!-viniférine!

Fig. III.4: Quantification relative d'une sélection de stilbènes au cours de l’infection par P. viticola.

NI: non-inoculé; Col: inoculation Colmar; Led: inoculation Lednice. En bleu, les échantillons non-inoculés; en vert les échantillons infectés par Colmar; en violet, les échantillons infectés par Lednice. Les intensités sont données en unité arbitraires.

"-viniférine!

Fig. III.5: Quantification relative d’une sélection de stilbènes au cours de l’infection par P. viticola.

Les conditions observées sont en abscisse. Les ordonnées sont en intensité (unité abstraite).NI: non-inoculé; Col: inoculation Colmar; Led: inoculation Lednice. En bleu, les échantillons non-inoculés; en vert les échantillons infectés par Colmar; en violet, les échantillons infectés par Lednice

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objective, sur la seule base de leur quantification différentielle en fonction des échantillons. Grâce à la précision en masse du spectromètre à technologie Orbitrap, des propositions d'identification des métabolites les plus intéressant pourront être formulées. Ces propositions pourront être validées si les standards correspondant sont disponibles.

Les données obtenues par LC-MS ont été traitées par le logiciel R avec le package XCMS (Smith et al., 2006). Après alignement de l'ensemble des chromatogrammes, 4477 ions ont été sélectionnés. Ces données ont été traitées par une analyse de variance prenant en compte l’effet temps (T12, T24, T48, T72) et l’effet inoculation (non-inoculé, Lednice, Colmar), suivie d’une analyse de Tukey pour déterminer précisément l’effet des variables. L'analyse de la variance (terme souvent abrégé par le terme anglais ANOVA : analysis of variance) est un test statistique permettant de tester si les différences de variation dans chaque groupe défini par les modalités des variables explicatives s'écartent de manière significative de la valeur 0. Dans notre cas, l’ANOVA est complétée par la méthode de Tukey qui permet de créer des intervalles de confiance pour toutes les différences deux à deux entre les moyennes des niveaux de facteurs, tout en contrôlant le taux d'erreur en tenant compte du nombre de tests effectués (dans notre cas, le niveau de confiance simultané est fixé a 95 %).

Ainsi, 12 modalités ont été analysées. Ces analyses ont été effectuées pour chacun des 4477 ions. Sept cent trente ions différentiellement accumulés dans au moins une des 12 conditions testées, avec une p-value inférieure à 0,001, ont été sélectionnés. Une première heatmap a été représentée à partir des 4477 ions de départ. Lorsque la p-value des ions est supérieure à 0,001, celle-ci a été remplacée par un 1 et apparait en noir (Fig. III.6).

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L’analyse comparative des conditions d’inoculations permet d’observer que les variations globales du métabolome provoquées par l’inoculation de P. viticola sont plus importantes à 48 et 72 hpi, ce qui était à priori attendu. De plus, deux groupes distincts d’ion se distinguent des autres. En haut, apparaissent les ions révélés lors de l’interaction compatible avec Lednice, dont les intensités sont significativement différentes dans les conditions « non-inoculé » et « inoculation Colmar». De la même façon, certains ions sont identifiés comme significativement différents lors de l’inoculation par Colmar par rapport aux témoins non inoculés et à l'inoculation par Lednice. Ces ions sont donc considérés comme caractéristiques de l’interaction incompatible. Enfin, le dernier groupe identifié correspond aux ions dont l'intensité est significativement différente entre les conditions inoculé et non-inoculé, indépendamment de la souche de P. viticola.

Ions révélés dans l’interaction compatible (inoculation Lednice)

Ions révélés dans l’interaction incompatible (inoculation Colmar)

Ions révélés par l’inoculation, indépendamment de la souche

Fig. III.6: Heatmap de la distribution des 730 ions sélectionnés sur leur p.value.

Représentation des ions (en ordonné) par condition d’analyse (abscisse). Un ion correspond à un trait. Les ions ayant une p.value inférieure à 0,001 dans au moins un des conditions analysées sont représentés en jaune, les autres sont en noirs. Led: Lednice; Col: Colmar; NI: non-inoculé.

12 24 48 72 Led / Col 12 24 48 72 Col / NI 12 24 48 72 Led / NI

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Ensuite, les "fold changes" des 730 ions sélectionnés ont été calculés, afin de déterminer lesquels sont sur- ou sous-représentés dans les 12 conditions analysées. Deux groupes d'ions sur-représentés ont été identifiés, correspondant respectivement à des ions accumulés lors de l’interaction compatible et incompatible (Fig. III.7).

Sur la base de leur masse déterminée avec une erreur généralement inférieure à 1 ppm, une formule brute et une identification putative a pu être proposée pour certains métabolites d'intérêt. L'exploitation des résultats n'est pas encore complète, mais quelques molécules différentiellement accumulées en condition compatible ou incompatible ont néanmoins pu être identifiées. Une grande proportion des ions accumulés à 72 hpi durant l’infection par Lednice semble être constituée de polymères d’hexoses. Ces molécules n'ont pas pu être formellement identifiées, faute de standards disponibles. De nombreuses molécules fortement

Ions sur-représentés lors de l’interaction compatible (inoculation Lednice)

Ions sur-représentés lors de l’interaction incompatible (inoculation Colmar)

Ions sous-représentés lors de l’inoculation par P. viticola

Fig. III.6: Intensités comparatives des 730 ions sélectionnés dans les 12 conditions analysées

Représentation de l’intensité des ions détectés (ordonné) par conditions analysée (abscisse) Les ions sur-représentés sont indiqués en vert, les ions sous-représentés en rouge.

Led: Lednice; Col: Colmar; NI: non-inoculé.

Fig. III.7: Intensités comparatives des 730 ions sélectionnés dans les 12 conditions analysées.

Représentation de l’intensité des ions détectés (ordonné) par condition analysée (abscisse). Les ions sur-représentés sont indiqués en vert, les ions sous-représentés en rouge. Led: Lednice; Col: colmar, NI: non-inoculé.

12 24 48 72

Led / Col Col / NI Led / NI

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accumulées 72 hpi dans les échantillons infectés par Colmar appartiennent à la famille des stilbènes ou aux flavonoïdes, confirmant les résultats obtenus par l'analyse ciblée. Par exemple, la δ-viniférine, l'ε-viniférine et le kaempferol-3-O-rhamnoside, accumulés après inoculation par Colmar, ont été identifiés avec certitude. Par ailleurs, l'un des ions fortement accumulé dans ces conditions pourrait correspondre à un dimère de picéatannol et resvératrol (Fig. III.8). A notre connaissance, ce type viniférine n’avait jamais été identifié durant l’interaction vigne-mildiou, mais sa structure devra néanmoins être confirmée.

2.3 Conclusions et perspectives

L’analyse par LC-MS de l’interaction entre la variété Bianca et les isolats Colmar et Lednice a mis en évidence des perturbations notables du métabolisme de la vigne durant les stades tardifs de l’infection. Certaines de ces perturbations sont spécifiques du type d'interaction compatible ou incompatible. Lors de l'interaction compatible avec l’isolat Lednice, les mécanismes de défense de la vigne ne semblent pas activés, ce qui pourraît être en relation avec la répression de l'accumulation d'acide jasmonique observée dans ces conditions. La confirmation de ces résultats pourrait indiquer que lors de l'interaction compatible, P. viticola possède des mécanismes permettant de réprimer la synthèse d'acide jasmonique et d'affaiblir ainsi les défenses de l'hôte. L'identification des molécules correspondant à une sélection d'ions particulièrement sur- ou sous-représentés lors des interactions avec Lednice et Colmar est actuellement en cours. Ceci permettra d'obtenir une

Fig. III.8: Structure putative du dimère de resvératrol et de picéatannol identifié dans cette étude.

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meilleure image des modifications métaboliques liées à l'infection par P. viticola en situation compatible ou incompatible. Les premiers résultats montrent que les stilbènes s'accumulent plus fortement lors de l'interaction incompatible, confirmant l'association de ces phytoalexines avec la résistance au mildiou (Malacarne et al., 2011).