Purification

Les mycoplasmes sont des bactéries exigeantes, cultivées dans des milieux de culture complexes, supplémentés en sérum et extrait de levure. Afin d’induire un stress nutritionnel, un milieu m-PPLO a été utilisé pour la production de VEs. Ce milieu, bien qu’appauvri en supplément, contient toujours 10% de supplément, et il est donc riche en protéines diverses qui peuvent perturber et compliquer la purification. Afin de pouvoir caractériser le contenu protéique des vésicules, il est nécessaire de mettre au point une approche de purification efficace. Deux approches ont été évaluées au cours de cette thèse.

4.3.1. Purification sur gradient discontinu:

La première approche de purification a consisté en la purification sur gradient discontinu (Chernov, Mouzykantov et al. 2014, Jang, Sweredoski et al. 2014), constitué de 10, 40 et 50% d’OptiPrep™ en PBS. Elle a été évaluée pour purifier les isolats de VEs décrits dans le chapitre II (Partie III, chapitre 1, section 4.2) qui avaient été obtenus à trois temps de croissance différents (phase exponentielle, stationnaire et de déclin) en milieu m-PPLO. Les vésicules ont été déposés en haut du gradient dans la fraction 10%.

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Figure 43 : Gradient discontinu. A : Schématisation du gradient discontinu composé des couches 50% d’OptiPrep en PBS, 40% et 10% où sont présentes les VEs. B : Séparation des VEs du reste du surnageant par gradient discontinu. Les flèches

noires indiquent la fraction, après centrifugation, où les vésicules sont présentes.

Après centrifugation, une fine couche blanchâtre s’est formée entre les couches 10 et 40% d’OptiPrep (Figure 43). Ellea été prélevée et déposée sur gel SDS-PAGE après dénaturation.

Figure 44 : SDS-PAGE des VEs isolées après purification sur gradient discontinu à partir de 3 cultures indépendantes de Mmm Afadé en milieu m-PPLO. (Ligne 1 et 11 : marqueur de taille ; 2 à 10 : VEs prélévées en : 2, 3 et 4 : phase exponentielle

; 5, 6 et 7 : phase stationnaire ; 8, 9 et 10 phase tardive). 1 / 2 / 3 / 4 / 5 / 6 / 7 / 8 / 9 /10 /11

expo stat déclin

180 kDa 130 kDa 100 kDa 70 kDa 55 kDa 40 kDa 35 kDa 25 kDa

182 Nous avons montré plus en amont dans le paragraphe « vésiculation et stade de croissance » (Partie III / Chapitre 1 / section 4.2) par MET et par marquage avec l’anticorps 3F3, que les VEs sont produites principalement en phase de déclin. Nous observons sur la Figure 44 que les profils protéiques sont similaires entre les différents isolats de VEs purifiés issus de phases de croissance différentes. Ce résultat démontre que cette méthode n’a pas été efficace pour éliminer les protéines contaminantes du milieu m-PPLO.

Afin de confirmer cette observation, les VEs purifiées sur gradient discontinu ont été déposées sur membrane et marquées avec la protéine G de Streptococcus sp. se liant aux IgG des mammifères.

Figure 45 : Marquage à la protéine G. Marquage des VEs en milieu m-PPLO ou marquage du milieu de culture non inoculé (Témoin) à la protéine G. Le marquage est équivalent entre les 4 dépôts.

Comme le montre la Figure 45, les VEs purifiées sur gradient discontinu sont toutes marquées par la protéine G. Le marquage est de la même intensité relative que celui du milieu non inoculé. Cela suggère que des protéines sériques de type IgG restent encore présentes dans les culots de VEs en milieu m-PPLO purifiés sur gradient discontinu et donc que notre approche de purification n’est pas satisfaisante. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 culture en phase exponentielle (m-PPLO) culture en phase stationnaire (m-PPLO) culture en phase de déclin (m-PPLO) milieu m-PPLO non inoculé (Témoin) Intens ité rel at ive m ar qua ge à la pr o téi ne G

183

4.3.2. Purification sur gradient continu:

Une approche alternative a donc été envisagée, elle consiste en l’utilisation d’un gradient de densité continu constitué de 6 couches allant de 35% à 10% d’OptiPrep™. Un culots vésiculaire décrit dans le chapitre II ; (Partie III chapitre 1 ; section 4.2) correspondant à un prélèvement réalisé durant la phase de déclin en milieu m-PPLO, a été mélangé à la couche 35% d’OptiPrep en PBS 1X. Après centrifugation, différentes fractions du gradient (Figure 46) ont été récoltées et une partie a été déposée sur membrane avant d’être marquée par l’anticorps 3F3.

Figure 46: Marquage au 3F3 des différentes fractions du gradient de densité continu récoltées apres centrifugation. A : schématisation de la répartition des fractions au sein du gradient. Ex : la fraction 1 déposée sur la membrane correspond à la première fraction de la zone 10% du gradient du schéma de droite. La flèche noire correspond à la fraction comprenant le dépôt initial de VEs en milieu m-PPLO et les flèches rouges indiquent les zones où des VEs ont été marquées par l’anticorps 3F3. B : Intensité de marquage au 3F3 en abscisse sont présentées les différentes fractions du gradient. C : dépôt et marquage au 3F3 des différentes fractions du gradient.

On observe qu’avec cette approche, des vésicules sont détectées à partir de la fraction 6 jusqu’à la fraction 12 (Figure 46). Le marquage le plus intense est celui de la fraction 9 du gradient correspondant à 25-30% d’Optiprep en PBS ce qui est en accord avec ce qui a pu être observé chez d’autres bactéries (Chutkan, Macdonald et al. 2013, Abdi, Yu et al. 2017, Wang, Thompson et al. 2018). Les différentes fractions du gradient continu ont ensuite été déposées sur gel SDS-PAGE pour évaluer la quantité de protéines.

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Figure 47: SDS-PAGE des différentes fractions du gradient continu. M : marqueur de taille. 1 à 12 : fractions du gradient.

On constate qu’un profil (puits 10 à 13 de la Figure 47) est observé dans les fractions du gradient de densité où un marquage est constaté par l’anticorps 3F3 (fractions 9 à 12) mais qu’aucun marquage n’est visible ailleurs sur le gel. Cela suggère que des protéines sériques ont pu être co-purifiées avec les VEs pour ces fractions de 9 à 12. La fraction 9 du gradient présentant un fort marquage 3F3, a été déposée sur membrane et marquée à la protéine G mais aucun marquage n’est repéré. Elle a ensuite été observée par microscopie électronique (Figure 48).

Figure 48: Microscopie électronique de la fraction 9 du gradient de densité continu. Les flèches noires suggèrent des exemples de VEs. M / 1 / 2 / 3 / 4 / 5 / 6 / 7 / 8 / 9 / 10/ 11 / 12 180 kDa 130 kDa 100 kDa 70 kDa 55 kDa 40 kDa 35 kDa 25 kDa 15 kDa 10 kDa

185 Les observations par microscopie électronique mettent en évidence quelques VEs mais aussi la présence d’amas laissant penser à des agrégats hétéroclites qui génèrent un bruit de fond. Celui-ci, même s’il est toujours présent, semble tout de même diminué par rapport aux premières observations par microscopie électronique (exemple : Figure 27). Ce bruit de fond pourrait être dû à un lavage insuffisant des fractions OptiPrep.