Contexte et objectifs de l’étude

Le genre Mycoplasma regroupe 19 (sous) espèces pathogènes pour les ruminants. Parmi les facteurs de virulence mis en évidence, la majorité sont des protéines présentes à la surface membranaire mycoplasmique (Tableau 5). Ces protéines participent à diverses étapes de l’interaction avec l’hôte à savoir l’adhésion, l’immunomodulation ou l’échappement à la réponse immunitaire ainsi qu’à la cytotoxicité. Pour autant, les mécanismes moléculaires associés à la pathogénèse des mycoplasmes des ruminants restent mal connus. L’étude des protéines libérées dans le milieu extracellulaire appartenant à l’exosécrétome pourrait permettre d’identifier de nouvelles protéines en interaction avec l’hôte.

Peu d’études se sont intéressées aux composés de l’exosécrétome car les mycoplasmes sont cultivés dans des milieux riches supplémentés en sérum et extrait de levure qui apportent de nombreuses protéines. Certains travaux ont pourtant montré la présence dans le milieu extracellulaire d’exopolysaccharides ayant des propriétés anti-inflammatoires ainsi que d’une nucléase (MBOV_RS02825) dégradant les NETs (Bertin, Pau-Roblot et al. 2013, Bertin, Pau-Roblot et al. 2015, Zhang, Zhao et al. 2016). Des approches de spectrométrie de masse ont permis d’observer 20 à 60 protéines potentiellement sécrétées par les mycoplasmes (Rebollo Couto, Klein et al. 2012, Voros, DeLongchamp et al. 2015, Paes, Lorenzatto et al. 2017). Ces résultats ont été obtenus sur une seule ou 2 espèces à la fois dans des milieux limités ou ne contenant pas de sérum donc différents de ceux utilisés habituellement. De plus, les auteurs ne se sont pas intéressés à la fonctionnalité des protéines identifiées ni au mécanisme de leur sécrétion. Durant cette thèse nous avons donc choisi d’utiliser une approche différente. Elle consiste à étudier des vésicules extracellulaires qui pourraient théoriquement être purifiées à partir de milieu complexe. Nous nous sommes également intéressés aux activités protéasiques extracellulaires pouvant également être détectées en milieu complexe et qui pourraient être recherchées chez de nombreuses espèces simultanément permettant de réaliser un screening large multi-espèces.

80 En amont de cette thèse, aucune étude ne s’était intéressée à la caractérisation de protéases actives extracellulaires. Chez d’autres bactéries, les protéases extracellulaires sont pourtant des facteurs de virulence participant à la dégradation de la matrice extracellulaire ou à la désorganisation de la réponse immunitaire (Laarman, Mijnheer et al. 2012, Kolar, Ibarra et al. 2013, Pietrocola, Nobile et al. 2017). Nous avons donc cherché à identifier les protéases présentes dans les surnageants de culture de différentes espèces mycoplasmiques. Comme peu d’information était disponible dans la littérature nous avons réalisé un crible large et nous nous sommes intéressés à 13 espèces pouvant être isolées des voies respiratoires des ruminants et sur lesquelles nous avons évalué l’activité caséinolytique extracellulaire permettant de détecter différents types de protéases. Ces recherches seront présentées dans la seconde partie de ce manuscrit.

Nous nous sommes également intéressés à un autre élément de l’exosécrétome, les vésicules extracellulaires (VEs). Celles-ci pourraient participer à la sécrétion de protéines, d’ADN etc… dans le milieu extracellulaire. Or chez les mycoplasmes les voies de sécrétion restent énigmatiques, ces vésicules pourraient donc être une voie alternative permettant de sécréter des protéines dans le milieu extracellulaire (Guerrero-Mandujano, Hernandez-Cortez et al. 2017). Les vésicules ont été décrites dans la littérature chez un Mollicutes, A. laidlawii et des recherches menées à l’UMR mycoplasmoses des Ruminants (ANSES- VetAgro-Sup) ont permis d’envisager que ces structures puissent être produites par des mycoplasmes des ruminants (Chernov, Chernova et al. 2011, Gaurivaud, Ganter et al. 2018). Pour faire suite au travail initié à l’UMR nous nous sommes intéressés à la composition membranaire de ces vésicules. Nous nous sommes également demandés si elles étaient produites par des bactéries viables ou si elles résultaient d’un processus dégénératif comportant une ré-association aléatoire de fragments membranaires. Ces recherches seront décrites dans la troisième partie de cette thèse au cours du premier chapitre.

Dans le second chapitre de nos recherches consacrées au VEs, nous avons cherché à améliorer l’approche de purification des VEs mycoplasmique afin de pouvoir in fine caractériser l’ensemble de l’exosécrétome vésiculaire. En effet, l’identification des protéines cytoplasmiques présentes à l’intérieur des vésicules nécessite de disposer de matériel de qualité suffisante permettant de limiter les potentielles contaminations par des mycoplasmes lysés et leurs protéines cytoplasmiques. Nous nous sommes donc intéressés à la fois aux conditions favorisant la production de VEs, à savoir si la modulation du pH pourrait participer à la formation de VEs, ainsi qu’aux conditions permettant de les purifier. Ces recherches sont présentées dans le second chapitre de la partie III de ce manuscrit.

81 Les travaux de cette thèse se sont appuyés sur les souchothèques des deux laboratoires d’accueil. Nous avons également utilisé une souche mutante obtenue de l’équipe du Dr. M. Brown (Université de Floride). Nous avons bénéficié d’un appui technique pour les identifications des protéines par spectrométrie de masse de la part des plateformes ProGénoMix du CEA et PAPPSO de l’INRA. Pour l’étude des vésicules, j’ai utilisé un savoir-faire qui a été développé au laboratoire de Lyon en amont de cette thèse. La possibilité d’utiliser les ultracentrifugeuses de l’UMR 5086 de l’IBCP et de l’équipe MND du laboratoire de Lyon ainsi que le microscope électronique à transmission de la plateforme CTµ de l’université de Lyon ont contribué au bon déroulement de ce travail.

La dernière partie (IV) de cette thèse propose une discussion générale pour l’ensemble des résultats obtenus.

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PARTIE II

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