Sauf indication, la composition des tampons et des solutions utilisés sont décrites par
III. Purification et caractérisation des biomolécules
III.1. A partir de souches de Streptomyces
III.1.1. Purification
Pour la purification des biomolécules et après leur extraction à partir du surnageant de la culture de la souche étudiée en utilisant le solvant organique adéquat (acétate d’éthyle) la phase organique obtenue est concentrée puis soumise à plusieurs étapes chromatographiques :
III.1.1.1. Chromatographie sur couche épaisse (CCE)
La chromatographie sur couche épaisse a le même principe que la chromatographie sur couche mince sauf que cette dernière permet une analyse qualitative alors que la première permet une étude quantitative. Après dépôt de l’extrait à analyser et élution avec le solvant qui nous permet de détecter la bonne séparation, la révélation est effectuée sous UV ce qui permet de marquer les différentes bandes qui existent.
Après grattage des différentes bandes séparément, le contenue correspondant est dissout dans un solvant adéquat. Après filtration et évaporation du solvant, la solution en conséquence est testée pour sa contenance des biomolécules. Si, cette dernière est biologiquement active, nous poursuivons la purification tout en utilisant d’autres techniques chromatographiques. Par ailleurs,
III.1.1.2. Chromatographie sur colonne
Dans la présente étude nous avons utilisé la chromatographie d’adsorption et la chromatographie de filtration.
* Chromatographie d’adsorption: Ce genre de chromatographie consiste à séparer les
différentes molécules selon leurs polarités. La colonne utilisée présente une longueur et un diamètre qui dépend de la quantité d’extrait à introduire. L’entassement est réalisé par un gel de silice 60 dissout dans un solvant apolaire puis l’élution sera faite par le même solvant tout en augmentant la polarité par un autre solvant plus polaire.
*Chromatographie d’exclusion : Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi
filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer. La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides, de type séphadex, gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution. Vu que le volume des billes est très finement calibré, les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement. En revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénètrent et y subissent des frottements qui les retardent. En effet, si l'on connaît la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté: c'est celui dont le domaine de fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier.
III.1.1.3. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est une technique instrumentale basée sur les mêmes principes que ceux que la chromatographie classique sur colonne. Elle peut donc mettre en œuvre selon la nature de la phase stationnaire, aussi bien des phénomènes de partage (qui sont les plus courants), que des phénomènes d’adsorption, d’échange d’ions ou d’exclusion. Dans notre cas nous avons utilisé une colonne C18 et comme éluant: A = eau et B = acètonitrile. Selon la nature de la séparation, on utilise un gradient d'élution ou on procède la séparation par un phénomène isocratique
Généralement, pour aboutir à des biomolécules pures, il est indispensable d’utiliser toutes ces différentes techniques chromatographiques. A chaque étape il faut tester l’activité biologique
de la solution en question et également procéder à des tests chimiques par le biais de la chromatographie sur couche mince CCM.
III.1.1.4. Chromatographie sur couche mince
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d’adsorptions; la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progressent le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium. Après le dépôt de l’échantillon sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant. Lorsque les composants de l’échantillon à analyser sont colorés, leur séparation est relativement facile sur la plaque. Dans le cas contraire, nous devons rendre les tâches visibles par révélation. Les méthodes de révélation utilisées sont les suivantes:
*Révélation par Radiation UV :En exposant la plaque à une source de radiation UV de 365
nm ou de 254nm, certains composés apparaissent sous forme de tâches brillantes.
* Révélation chimique : p-anisaldehyde: (84 / 14/ 1/ 0,5) méthanol, acétate d’éthyle, acide
sulfurique, p-anisaldehyde. Ce genre de révélateur permet de mettre en évidence la présence de plusieurs substances entre autres des glycosides, antioxydants, stéroïdes, sapoginines, phénols, alcools et des macrolides.
III.1.2. Caractérisation chimique des biomolécules
Pour la détermination de la structure chimique des biomolécules purifiées à partir des surnageants des cultures des souches de Streptomyces, nous avons utilisé plusieurs techniques spectroscopiques :
III.1.2.1. Spectre Ulrat Violet (UV)
La région de l’UV s'étend de 10 nm à 400 nm mais les spectromètres UV usuels ne permettent le tracé des spectres que pour les longueurs d'onde comprises entre 200 nm et 400 nm (proche UV). Un spectre UV (ou visible) résulte de l'absorption de radiations UV (ou visibles) par une molécule. Dans les régions UV et visible, les longueurs d'ondes correspondent à des différences d'énergie DE = E2 - E1 (DE = hc/l avec l, longueur d'onde de la radiation) qui
restitution sous forme de lumière de l'énergie absorbée. Le principe de dosage par spectrophotométrie UV–visible consiste à chercher l’absorbance à chaque valeur de la longueur d’onde. On utilise un système de type monochromateur pour fixer la longueur d’onde et un photomultiplicateur pour enregistrer l’absorbance correspondante. La variation de la longueur d’onde sur une plage adéquate permet d’obtenir un spectre d’absorption.
Pour cette détermination :
- Dissoudre la molécule pure dans un solvant adéquat - Préparer une cuve de solvant qui servira de référence.
- Faire un spectre d’absorption de la molécule dans un domaine compris entre 185 et 400 nm.
III.1.2.2. Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une méthode spectroscopique polyvalente utile aussi bien en analyse quantitative que structurale. Elle est généralement utilisée en complément des autres méthodes de spectroscopie classiques et de la spectrométrie de masse pour localiser les atomes, de préciser la formule développée et la stéréochimie du composé étudié.
Le spectre RMN est constitué d’un diagramme représentant des signaux de résonance émis par certains noyaux atomiques de l’échantillon. Pour obtenir ces signaux, l’échantillon est soumis à l’action conjointe de deux champs magnétiques dont l’un est intense et fixe, tandis que l’autre est environ 10.000 fois plus faible et variable.
RMN 2D : Les spectres RMN 2D possèdent des données de déplacement chimiques sur deux
axes de fréquences. Ils permettent une corrélation des fréquences de résonance de différents noyaux. On distingue des corrélations homo ou hétéronucléaire, selon que F1 ou F2 (les deux axes de fréquence) contiennent des fréquences de noyaux de même espèce ou d’espèce différents.
*Expérience COSY (COrrelation SpectroscopY) :
Cette expérience permet de visualiser des taches de corrélations dites aussi signaux ou pics d’intersections hors diagonale indiquant les noyaux qui sont couplés entre eux. L’expérience permet à l’aide de ces pics d’intersection, de noter les corrélations entre protons géminés non équivalents et vicinaux et d’obtenir des informations sur la structure moléculaire.
* Expérience HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) :
Elle permet de visualiser sur un spectre à deux dimensions (1H-13C) les taches de corrélation correspondantes au couplage direct 1J des protons avec les carbones qui les portent.
* Expérience HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) :
Elle permet de visualiser les taches de corrélation entre un noyau 13C et un noyau 1H via
un couplage à longue distance 2J et 3J. On peut ainsi observer les carbones quaternaires grâce aux protons se trouvant à des distances 2J et 3J. Cette expérience permet de déterminer l’enchaînement du squelette carboné de la molécule étudiée.
III.1.2.3. Spectroscopie de Masse
Parmi les différentes méthodes d’analyses structurales utilisées en chimie organique, la spectrométrie de masse présente l’originalité de s’adresser à des substances analysées en phase gazeuse et non en phase liquide condensée. Toutes les techniques de spectrométrie de masse font appel non aux espèces moléculaires en tant que telles mais aux entités ioniques qui en proviennent. Tous les procédés de spectrométrie de masse reposent en effet sur les déplacements de particules chargées dans des champs électromagnétiques. Cela nécessite donc, pour que l’analyse d’une substance organique soit réalisable en spectrométrie de masse, une étape préalable d’ionisation de l’échantillon.
Un spectromètre de masse comporte trois parties distinctes : Une source d’ion, un analyseur et un détecteur