BIOMOLECULES DE LA SOUCHE DE Streptomyces microflavus sp Fr
III. Extraction et purification des biomolécules de la souche de Streptomyces microflavus sp Fr
III. 1. Extraction
La nouvelle souche de Streptomyces microflavus sp. Fr10 a été sélectionnée durant des travaux antérieurs pour ses activités antimicrobiennes importantes contre les bactéries à Gram+ et à Gram- et les champignons. Les conditions de production de biomolécules de cette souche ont été également optimisées lors de travaux antérieurs réalisés au LMB-CBS. Les meilleurs conditions retenues sont : Le milieu Bennett ayant comme source de carbone le glycérol à 0,5% ; une température de croissance de 30°C avec une agitation de 250 rpm. Les additifs chimiques testés « MgSO4, 7H2O (2 mM) ; K2HPO4 (1 mM) et les oligo-éléments » n’ont pas d’effet sur la
production de biomolécules.
Pour l’extraction et la purification des biomolécules de cette souche nous avons préparé un volume de surnageant actif de 35 litres (7 fermentations de 5 litres chacune) utilisant les conditions optimales décrites ci-dessus. Après incubation de 72 h à 30°C, le jus de fermentation est filtré puis centrifugé. Le surnageant obtenu est extrait deux fois par un volume égal d’acétate d’éthyle. La phase organique biologiquement active, est évaporée à sec par Rotavapor. Les sept extraits secs obtenus (des sept fermentations successives) de couleur marron ont été mélangés pour donner une
masse totale de 3g et puis dissous dans 5 ml de dichloro-méthane - méthanol (DCM 95% - MeOH 5%).
Les tests biologiques réalisés sur les extraits secs collectés montrent un fort pouvoir inhibiteur de ces extraits contre les bactéries à Gram+ et à Gram- et les champignons (Tableau 31).
Tableau 31. Activités biologiques des extraits secs collectés de la souche de Streptomyces microflavus sp. Fr10: Pour chaque test, 50 µl (du mélange 5 ml de dichloro-méthane – méthanol) ont été déposés.
Cellules indicatrices M. luteus LB 14110 S. aureus ATCC 6538 S. enterica ATCC43972 E. Coli ATCC 8739 Fusarium.sp Φ(mm) 22 23 25 19 20
III. 2. Purification
La figure 41, présente le schéma global adopté pour la purification de six molécules bioactives (M1 – M6) de la souche de Streptomyces microflavus sp. Fr10
Bactérie Streptomyces microflavus sp.Fr10 Culture liquide 35 litres
Centrifugation
Culot cellulaire Surnageant
Extraction deux fois par l’acétate d’éthyle Evaporation Extrait sec (3,0 g) CCE FVI FV FIV M6 FIII FI FII HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC M5 M4 M3 M2 M1
Figure 41 : Les différentes étapes utilisées pour la purification des six biomolécules de la souche de Streptomyces microflavus sp. Fr10
Les six molécules bioactives ont été obtenues à l’état pur suite à deux étapes chromatographiques : Une chromatographie sur couche épaisse suivie par une chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Les tests d’inhibition de la croissance des microorganismes utilisés comme cellules indicatrices ont montré que :
* Les molécules M1, M2 et M6, à l’état pur, possèdent une forte activité inhibitrice contre les champignons et les bactéries à Gram+ et à Gram-.
* Les molécules M3, M4 et M5, à l’état pur, possèdent des activités antibactériennes uniquement contre les bactéries à Gram+. Egalement, ces molécules possèdent des activités antifongiques qui sont moins importantes que celles des molécules M1, M2, et M6.
Nous avons déterminé, par la technique LC/MS/MS, les masses de ces six biomolécules pures (Figure 42 A-F). Ces masses MW en Da sont : M1 = 413 ; M2 = 300 ; M3 = 279 ; M4 = 194 ; M5 = 239 et M6 = 290g/mol.
Figure 42 B : Masse moléculaire MW de la biomolécule pure M2
Figure 42 C : Masse moléculaire MW de la biomolécule pure M3
Figure 42 D : Masse moléculaire de la biomolécule pure M4
110.8 153.9 168.8 201.8 278.7 388.7 +MS, Line, 2.0min (#64), 100%=50592828 0 1 2 3 4 5 7 x10 Intens. 100 200 300 400 500 600 700 800 m /z 124.9 151.9 191.8 214.9 282.8 +MS, Line, 2.0min (#68), 100%=28289912 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 7 x10 Intens. 100 200 300 400 500 600 700 800 m /z
Figure 42 E: Masse moléculaire de la biomolécule M5
Figure 42 F: masse moléculaire de la biomolécule pure M6
Les analyses spectroscopiques sont actuellement en cours pour la détermination de la structure chimique de ces six biomolécules pures.
99.9 145.9 177.8 216.8 238.8 1. +M S, Line, 6.1-6.4min (#188-#200), 100%=44994181 83.9 97.9 124.9 190.9 238.7256.7 278.2 329.6 351.6 380.3 412.8 449.9 494.0 520.5 593.3 628.7 1. +M S2(238.9), Line, 6.1-6.4m in (#189-#201), 100%=67355 0 1 2 3 4 5 7 x10 Intens. 0 1 2 3 4 4 x10 100 200 300 400 500 600 700 800 m /z 59.1 121.9 145.9 210.9 238.8 289.8 311.7 422.6 4. +MS, Line, 2.4m in (#76), 100%=13027433 126.9 154.8 196.8 4. +M S2(290.0), Line, 2.4min (#77), 100%=7941802 0.0 0.5 1.0 1.5 7 x10 Intens. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 7 x10 100 200 300 400 500 600 700 800 m/z
Conclusion
Les résultats des travaux de recherche se rapportant à ce deuxième chapitre, peuvent être résumés comme suit :
* Nous avons optimisé les conditions de production des biomolécules de la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN17. Les conditions de cultures retenues sont : milieu TSB à 30 g/l additionné de glucose à 1 % w/v et de K2HPO4 « 1mM ». La température d’incubation est de 30°C
avec une agitation de 250 rpm en Erlenmayer. En utilisant ces conditions nous avons préparé une culture de 30 litres dans un fermenteur (500 rpm et 30°C).
* Après une double extraction du surnageant par l’acétate d’éthyle, l’extrait sec actif obtenu a été soumis à plusieurs étapes chromatographiques (Séphadex LH-20, Chromatographie sur couche épaisse et chromatographie en phase liquide à haute performance). Trois molécules pures biologiquement actives (M1, M2 et M3) ont été obtenues et les structures chimiques correspondantes ont été caractérisées par le biais de plusieurs techniques spectroscopiques. Il s’agit de :
- M1 (MW = 269 g/mol) c’est un dérivé de DKP (L-Leu, L-Arg). Cette molécule possède des activités antibactériennes contre les bactéries à Gram+ et à Gram- et antifongiques.
- M2 (MW = 390 g/mol), c’est un dérivé de phtalate le di-(2-éthylhexyl) phtalate. Cette molécule possède des activités antibactériennes contre les Gram+ et des activités antifongiques.
- M3 (Mw = 488 g/mol), c’est tétrapeptide cyclique;
le 1 - [2 -(cyclopentanecarbonyl-3-phenylpropionyl] - pyrrolidine-2-carboxylique (1-carbamoyl- propyl)-amide. Cette molécule possède des activités antibactériennes contre les Gram+ et des activités antifongiques.
* Nous avons également préparé une culture de 35 litres à partir de la deuxième souche étudiée, la souche de Streptomyces microflavus sp. Fr10. Après une double extraction par l’acétate
d’éthyle du surnageant correspondant, l’extrait sec actif a été soumis à deux étapes de purification : Une chromatographie sur couche épaisse suivie par une chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Six molécules bioactives ont été obtenues (M1-M6). Les masses moléculaires de ces dernières sont : M1 = 413 ; M2 = 300 ; M3 = 279 ; M4 = 194 ; M5 = 239 et M6 = 290g/mol.
Les travaux de recherche relatifs à la souche de Streptomyces lilaceus sp. TN17 ont fait l’objet d’un article publié dans le Journal à Comité de lecture Internationale : Natural Product Research et un brevet National :
Article
Slim Smaoui, Lotfi Mellouli*, Ahmed Lebrihi, Yannick Coppel, Lilia Fourati-Ben Fguira and
Florence Mathieu (2009). Purification and structure elucidation of three naturally bioactive molecules from the new terrestrial Streptomyces sp. TN17 strain. Natural Product Research. In press
Brevet
Slim SMAOUI, Florence MATHIEU, Ahmed LEBRIHI, Yannick COPPEL, Lilia FOURATI Ben FGUIRA, Lobna ELLEUCH, Samir BEJAR et Lotfi MELLOULI* (2009). Trois molécules biologiquement actives, dont une nouvelle dérivé de dikétopipérazine, produites simultanément à partir d’une nouvelle souche bactérienne appelée Streptomyces sp. TN17. INNORPI TUNISIE TN2009/0065.