(gèner échantillo n =
5. Analyse in silico des séquences
5.5 Modélisation des structures tridimensionnelles
6.2.13 Recherche de partenaires protéiques des GST de Laminaria digitata
6.2.13.2 Pull-down
Le Pull-down est une technique qui permet de mettre en évidence, in vitro, l'interaction entre deux ou plusieurs protéines. Pour réaliser cette technique, il est nécessaire d'avoir une protéine purifiée et étiquettée qui sert d'appât, et un extrait dans lequel se trouvent les partenaires potentiels (les proies).
La résine de nickel, Talon Metal Affinity Resin (Qiagen), utilisée pour fixer l'appât, est préparée à raison de 1 mL pour 1,5 mg de protéine dans un tube Eppendorf. La résine est lavée (agitation, centrifugation, élimination du surnageant) avec 10 volumes de tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2. Puis l'appât, c'est-à-dire la GST recombinante (180 µg) possédant une étiquette composé de 6 résidus histidine, est fixé sur la résine par rotation pendant une heure à 4°C. La fraction non retenue est éliminée après centrifugation 10 mi à 4°C et 5000 rpm.
L'incubation avec les proies potentielles s'effectue par ajout de l'extrait protéique total (3800 µg) sur la résine et rotation pendant 18 heures à 4°C. La fraction ne présentant pas d'affinité pour l'appât ou la résine est éliminée après centrifugation. Les complexes appât – proies sont ensuite lavés avec 10 volumes de tampon Tris-HCl 50 mM pH7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 pour éliminer les interactions non spécifiques. Un aliquot de la résine est ensuite prélevé et directement déposé sur un gel dénaturant SDS-PAGE. Un contrôle sans appât est également réalisé afin d'identifier les interactions non-spécifiques générées par la résine sur
Tris-HCl 50 mM pH7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidazole. Cependant cette étape dilue l'échantillon et rend l’analyse sur gel difficile.
Tableau 11: Liste des oligonucléotides utilisés au cours de mon travail de thèse. Gène Localisation ou utilisation Oligonucléotide Séquence Sens GST 8_1F 5’- GCACACACTCTCAGTCCCCTT-3’ LdGST1
Séquence codante Antisens
GST 8_1R 5’- CGCAATGTACGCACTACACAT-3’ Sens GST8_PCRq_3F 5’-GCAGAGCCTCGCCCAGATGA-3’ LdGST1 PCRq Antisens GST8_PCRq_3R 5’-CCATAGCTGCGTCGGCGAAT-3’ Sens 5'GST78 5’-ATGGCTCCCACCACATCTTTG-3’ LdGST2
Séquence codante Antisens
3'GST78 5’-TTACTTGTTGGTGGTCTCTGA-3’ Sens 78GST3 5’-AGGCTGGTCTGGCTGAAGGAA-3’ LdGST2 PCRq Antisens 78GST4 5’-TGGTCTCTGATCTCTCCTGGTGG-3’ Sens 5'GST54 5’-ATGGCTCCCAAGCTGGTCCTG-3’ LdGST3
Séquence codante Antisens
3'GST54 5’- CTACTTGTCGTGCTTGGCGAT-3’ Sens GST54_PCRq_1F 5’-ATACGCTGGGCTTTGGAGCAA-3’ LdGST3 PCRq Antisens GST54_PCRq_1R 5’-GGCTGGGCTTGACAACACCA-3’ Sens GST19_1F 5’-ACCATGCCGGCTGTCTTTA-3’ LdGST4
Séquence codante Antisens
GST19_1R 5’-TGCAGTTTACGCCTTGGAA-3’ Sens 19GST1 5’-GCGGAGGACGTGTTCATCA-3’ LdGST4 Intron Antisens 19GST2 5’-CAAAGTCTGGCACTTCTCCAACT-3’ Sens GST19_PCRq_1F 5’-ATACCAGATGGACGGCACCGA-3’ LdGST4 PCRq Antisens GST19_PCRq_1R 5’-AGGCTAAAGGGCATTCCGGG-3’
Antisens EsGST1_PCRq_2R 5’-TACAAAGCGCAGAGGGAAGGG-3’ Sens EsGST2_PCRq_2F 5’-CCTCCGCACTCTCCGCTTAC-3’ EsGST2 PCRq Antisens EsGST2_PCRq_2R 5’-GTCTTCCGCAACGCACTACTG-3’ Sens EsGST3_PCRq_2F 5’-ACAACATCGCCCGAAGGAC -3’ EsGST3 PCRq Antisens EsGST3_PCRq_2F 5’-TGTCTTATCTCAACAAACCTCACC-3’ Sens CL4853_PCRq_2F 5’-CGCATGTCTGTGGTTCACCTATTC-3’ EsGST9 PCRq Antisens CL4853_PCRq_2R 5’-GCCAACTACACACGGAAGGG-3’ Sens CL1683_PCRq_2F 5’-ATGCCCGTGTTGGAGGTAGATG-3’ EsGST12 PCRq Antisens CL1683_PCRq_2R 5’-GCACTGTCGGCGAAAGCG-3’ Sens CL3957_PCRq_1F 5’-AGCGAAAGGGAAGTACATGAAGGG-3’ EsGST13 PCRq Antisens CL3957_PCRq_1R 5’-TTGGGCGGCGAGCGTCTC-3’ Sens mEsGST1_PCRq_2F 5’-TTGGGTTGTTGACAGTCAGAGAG-3’ mEsGST1 PCRq Antisens mEsGST1_PCRq_2R 5’-CAAACCAATACGGACGCTATGC-3’ Sens CL1335_PCRq_1F 5’-CCGAACGGGCAGAAGGTCAC-3’ Esi0047_0117 PCRq Antisens CL1335_PCRq_1R 5’-CGACATGATGTTTGTGTACCAAGC-3’ Sens CL754_PCRq_1F 5’-CCTGCCCCTGGTGTCATCG-3’ Esi0019_0095 PCRq Antisens CL754_PCRq_1R 5’-TCATCCATGTAGGAGAAGGTCACG-3’ Sens mEsGST2_PCRq_2F 5’-TTGGTGGTACTCGCTGTGGTTAG-3’ mEsGST2 PCRq Antisens mEsGST2_PCRq_2R 5’-CCCGCACGCAGAGCAAATAC-3’ Sens EsEF1a5' 5’- GCAAGGGCCTCAGCTCTG -3’ EsEF1a PCRq Antisens EsEF1a3' 5’- ACAAGCCGTCTGGGTATATGTTAGC -3’ EsTUA PCRq Sens EsTUA5' 5’- TTTGAGGAGTTTCGTCGGAGAT-3’
Antisens EsTUA3' 5’- CACACAGCGCAAAACGGC-3’ Sens EsACT5' 5’- CCCAGATCATGTTCGAGACGTT -3’ EsACTIN PCRq Antisens EsACT3' 5’- CACGCCGTCACCCGAGTC -3’ Sens Tuba2-1 5’-TCGTGCAGTTGGGTTTCGA-3’ LdTUA PCRq Antisens Tuba2-2 5’-CAAGACGCCATGCGATACG-3’ Sens Pld17B08-fw1q 5’-ATCGCGGCTTGTGTCTCTTG -3’ LdRPL36 PCRq Antisens Pld17B08-rev1q 5’-ACCGCACACCAACCCTTTC -3’ Sens LdAct_fw3q 5’-GGATGTCGCGCACGATCT-3’ LdACTIN PCRq Antisens LdAct_rev3q 5’-ACCTGACGGACAACCTGATGA-3’ Sens 5’-GGGGGGGGATCCGCTCCCAAACTCATCCTCACGTA-3’ EsGST1
Clonage pFO4 Antisens 5’-CCCCCCGAATTCTTACTTGGCGTGCTTGGCGAGGAAT-3’
Sens 5’-GGGGGGGGATCCTCTTCCACGCCCACCCTCAACT-3’
EsGST3
Clonage pFO4 Antisens 5’-CCCCCCGAATTCTTACGCCTTGGAGGCGTAGTACGC-3’
Sens 5’-GGGGGGGGATCCGGCCCCAAGCTTATCCTCTCGT-3’
LdGST1
Clonage pFO4 Antisens 5’-CCCCCCGAATTCTTATGGCCCGGACTCCAAGTACTTG-3’
Sens 5’-GGGGGGGGATCCGCTCCCACCACATCTTTGACCC-3’
LdGST2
Clonage pFO4 Antisens 5’-CCCCCCCAATTGTTACTTGTTGGTGGTCTCTGATCTC-3’
Sens 5’-GGGGGGGGATCCGCTCCCAAGCTGGTCCTGACG-3’
LdGST3
Clonage pFO4 Antisens 5’-CCCCCCGAATTCTTACTTGTCGTGCTTGGCGATGAACG-3’
Sens 5’-GGGGGGGGATCCCCGGCTGTCTTTAACTACTTCG-3’
LdGST4
Clonage pFO4 Antisens 5’-CCCCCCGAATTCTTACGCCTTGGAAGCG-3’
Sens 5'- GGGGGGGGATCCACCATGGCTGTGACCATCGAGCTCACACCC-3' mEsGST1
Clonage levure Antisens 5'-CCCCCCGAATTCCTACATGTAAACCTTCACGACGGA-3'
Sens 5'- GGGGGGGGATCCACCATGGCTGTGACCATCGAGCTCACACCC-3' mEsGST2 Clonage levure Antisens 5'-CCCCCCGAATTCCTAGGATATGCAAAGCTTCGTGGT-3' Sens 5’-GGGGGGGGATCCACCATGGCTACCATGACCATCGAACTTACC-3’ mCcGST1
Clonage levure Antisens 5’-CCCCCCGAATTCTCAGCAGCATGTCTTGACCACGAG-3’ Sens 5’-GGGGGGGGATCCACCATGGCTGAAGTAACGCTCCCGCCGCTG-3’ mCcGST2
Tableau 12: Numéros d'accession des séquences utilisées pour l’analyse phylogénétique des GST cytosoliques.
Classe Gène Organisme N°accession
EcGSTB Escherichia coli AAC74707
PmGSTB Proteus mirabilis P15214 Bêta
OaGSTB Ochrobactrum anthropi CAA76728
MsGSTR Micropterus salmoides AAQ91198
PmGSTR1 Pagrus major BAD98443 Rho
PpGSTR Pleuronectes platessa CAA45293
CeGSTO1 Caenorhabditis elegans AAA27959
TrGSTO Takifugu rubripes AAL08414 Omega
MmGSTO1 Mus musculus NP_034492
RnGSTA2 Rattus norvegicus P04903
HsGSTA1 Homo sapiens NP_665683
GgGSTA4 Gallus gallus NP_990149 Alpha
DrGSTA2 Danio rerio NP_998559
HsGSTM5 Homo sapiens NP_000842
BtGSTM1 Bos taurus AAI02051
MmGSTM3 Mus musculus AAH44927 Mu
MfGSTM2 Macaca fascicularis AAF08540
BtGSTP Bos taurus AAI02705
MmGSTP1 Mus musculus AAH61109
HsGSTP1 Homo sapiens AAH61109 Pi
RnGSTP Rattus norvegicus NP_036709
GgGSTS1 Gallus gallus CAA07005
OsGSTS Ommastrephes sloanei P46088
TjGSTS Tigriopus japonicus AAY89316
AgGSTS1 Anopheles gambiae L07880
AgGSTS Anopheles gambiae P46428
SiGSTS Solenopsis invicta Q6X4T7
BgGSTS Blatella germanica O18598
BmGSTS Bombyx mori Q5CCJ4
MdGSTS Musca domestica P46437
HsPDGS Homo sapiens AAH20734
RnPGDS Rattus Norvegicus 035543
CiPGDS3 Ciona intestinalis Q0PMD3 Sigma
XtPGDS2 Xenopus tropicalis Q6DES8
CeGSTG1 Cunninghamella elegans AAL02368 Gamma
CeGSTG2 Cunninghamella elegans AAL02369
AcGSTN1 Ancylostoma caninum AAT37718
NdGSTN2 Nematospiroides dubius AAF36480 Nu
HcGSTN1 Haemonchus contortus AAF81283
AgGSTD2 Anopheles gambiae CAA96104
AgGSTD1-5 Anopheles gambiae CAB03592
SsGSTD Sarcoptes scabiei AAV65948 Delta
DmGSTD Drosophila melanogaster AAB26519
AgGSTE2 Anopheles gambiae AAV68398
DmGSTE17534 Drosophila melanogaster AAF57693 DmGSTE17522 Drosophila melanogaster AAF57702 AtGSTT10 Arabidopsis thaliana CAA10457
EeGSTT1 Euphorbia esula AAF64449
HsGSTT1 Homo sapiens AAL31549 Thêta
RnGSTT2 Rattus norvegicus AAH61856
BnGSTZ Brassica napus AAO60042
OsGSTZ Oryza sativa AAG32474
HsGSTZ1 Homo sapiens NP_665877 Zêta
MmGSTZ1 Mus musculus AAH31777
NtGSTF1 Nicotiana tabacum A41789
NtGSTF2 Nicotiana tabacum P46440
AtGSTF4 Arabidopsis thaliana CAB80745 Phi
ZmGSTF3 Zea mays CAA29929
AtGSTL Arabidopsis thaliana CAB86032
GmGSTL Glycine max AAG34872
PsGSTL Pisum sativum BAC81649 Lambda
TaGSTL Triticum aestivum CAA76758
AtGSTU4 Aegilops tauschii AAM89393
OsGSTU3 Oryza sativa AAQ02687
PtGSTU Pinus tabuliformis AAY64044 Tau
CmGSTU3 Cucurbita maxima BAC21263
LdGST1 Laminaria digitata EF422836
LdGST2 Laminaria digitata EF422837
LdGST3 Laminaria digitata EF422838
LdGST4 Laminaria digitata EF422839
EsGST1 Ectocarpus siliculosus FP089530
EsGST2 Ectocarpus siliculosus FP089529
EsGST3 Ectocarpus siliculosus FP089528
EsGST4 Ectocarpus siliculosus FP089527
EsGST5 Ectocarpus siliculosus FP089526
EsGST6 Ectocarpus siliculosus FP089525
EsGST7 Ectocarpus siliculosus FP089524
EsGST8 Ectocarpus siliculosus FP089523
EsGST9 Ectocarpus siliculosus FP089522
EsGST10 Ectocarpus siliculosus FP089521
EsGST11 Ectocarpus siliculosus FP089520
EsGST12 Ectocarpus siliculosus FP089519
SbGST2 Sargassum binderi DV669544
FvGST1 Fucus vesiculosus CL225Contig1a
FsGST1 Fucus sp CL169Contig1a
Algues brunes
FsGST2 Fucus sp CL290Contig1a
a
http://www.sb-roscoff.fr/SIG/blast/blast_private.html
b
http://gracilaria.ib.usp.br/cgi-bin/gracilaria/cap3/cluster_editor/gene_list.pl?categ=ALL
Numéro d’accession pour EsGST13 = FP089518
Tableau 13: Numéros d'accession des séquences utilisées pour l’analyse phylogénétique des GST microsomales.
Cluster Espèces Numéro d’accession
Pseudomonas syringae NP_790229 Rhodopseudomonas palustris ZP_00009790 Bacteria Chromobacterium violaceum NP_899939 Homo sapiens P10620 Rattus norvegicus P08011 MGST1 Danio rerio BM532930
Anopheles gambiae AAP37005 Insectes
Anopheles gambiae AAP37004
Ciona intestinalis BW302022
Homo sapiens O14684 PGES
Rattus norvegicus AAG24803
Rattus norvegicus P20291
Homo sapiens P20292 FLAP
Danio rerio AAH53181
Gallus gallus BU419439
Rattus norvegicus BAB58882 LTC4 synthase
Homo sapiens Q16873
Hydra magnipapillata BP512502
Homo sapiens Q99735
Danio rerio AL921814 MGST2
Salmo salar CA038571
Synechocystis sp. P73795
Synechocystis cluster
Rhodopseudomonas palustris ZP_00009580
Xenopus laevi AW644270
Homo sapiens O14880
Arabidopsis thaliana AAM66941
Chondrus crispus mGST1 CO650933
Chondrus crispus mGST2 CO649734
Ectocarpus siliculosus mGST1 FP089517 Ectocarpus siliculosus mGST2 FP089516 MGST3 Ectocarpus siliculosus mGST3 FP089515 Magnetospirillum magnetotacticum ZP_00052499 Escherichia coli P64515 E. coli cluster Yersinia pestis NP_405603