Les enzymes du cycle γγγγ -glutamyl

2.2.1 Synthèse du glutathion

La synthèse du glutathion fait intervenir deux enzymes ATP-dépendantes. La première enzyme est la glutamate-cystéine ligase (GCL, E.C.6.3.2.2), également nommée γ -glutamylcystéine synthétase, et catalyse la réaction suivante :

Chez les mammifères, GCL est un hétérodimère constitué d'une petite sous-unité régulatrice (GCLM) et d'une grande sous-unité catalytique (GCLC) (Seelig and Meister, 1985). GCLC présente une taille de 73 kDa et possède la totalité du site catalytique nécessaire à l'activité GCL, et le site de rétro inhibition par le glutathion. GCLM présente une taille de 31 kDa et

possède une activité régulatrice lorsqu'elle est associée à GCLC en augmentant la constante d'inhibition (Ki) du GSH, réduisant ainsi la rétro inhibition de la grande sous-unité (Choi et al., 2000). En revanche, chez les plantes aucun gène codant pour la sous-unité régulatrice n'a été identifié à ce jour (Foyer and Noctor, 2005).

La seconde enzyme est la glutathion synthétase (GS, E.C.6.3.2.3) qui catalyse la réaction suivante:

Cette enzyme, active sous la forme d'un homodimère de 118 kDa, catalyse l'addition d'une glycine sur le L-γ-glutamylcystéine produit par la GCL pour former le glutathion.

Dans le génome humain, les gènes codant pour GCL et GS sont présents en une seule copie (Dickinson and Forman, 2002). Etant donné l'importance du glutathion dans le métabolisme cellulaire, les gènes codant pour les enzymes de synthèse sont fortement régulés. Chez

Arabidopsis thaliana, GCL et GS sont également codées par un seul gène chacune, et la

présence de peptide signaux suggère que la protéine GCL est plutôt localisée dans le chloroplaste tandis que GS est majoritairement cytosolique (Foyer and Noctor, 2005).

2.2.2 Dégradation du glutathion

Le glutathion est un tripeptide particulier car il présente une liaison amide entre l'amine alpha de la cystéine et le groupement carboxyle (gamma) du radical glutamate. Une liaison peptidique dite "classique" s'opère entre le groupement carboxyle du carbone alpha d'un acide aminé et le groupement amine du carbone alpha de l'autre acide aminé. De ce fait, la liaison peptidique entre le glutamate et la cystéine du glutathion n'est pas clivable par les protéases intracellulaires (Stark et al., 2003). La dégradation est donc initiée par la γ-glutamyl transpeptidase (GGT). Cette aminopeptidase (E.C.3.4.11.2) peut utiliser plusieurs substrats.

Tout d'abord, elle peut hydrolyser le glutathion réduit pour former du glutamate et un dipeptide de cystéinylglycine (1). Deuxièmement, elle peut transférer le groupement γ -glutamyl vers un accepteur (2). Les isomères de cystine (dipeptide de cystéines liées par un pont disulfure) et les méthionines sont généralement de bons accepteurs du groupement γ -glutamyl. Enfin, cette enzyme est capable de réaliser une auto-transpeptidation qui est un transfert du groupement γ-glutamyl vers le GSH, formant ainsi du γ-glutamyl-glutathion. Le GSH, le GSSG et les composés S-glutathionylés sont les substrats de cette enzyme.

Cette enzyme est particulièrement importante car elle participe au transport des acides aminés. En effet, la γ-glutamyl transpeptidase est localisée sur la face externe des membranes cellulaires et le glutathion est transporté à l'extérieur des cellules où a lieu le transfert du groupement γ-glutamyl sur un acide aminé. Le dipeptide de cystéinylglycine et l'acide aminé

γ-glutamylé formés sont ensuite transportés vers le milieu intracellulaire.

La γ-glutamyl cyclotransférase (E.C.2.3.2.4) convertit l'acide aminé γ-glutamylé en 5-oxoproline et en acide aminé correspondant au cours de la réaction suivante:

Cette enzyme soluble est très active envers les dérivés γ-glutamylés de glutamine, d'alanine, de cystéine, de cystine et de méthionine (Meister and Anderson, 1983).

La oxoprolinase (E.C.3.5.2.9) est une enzyme ATP dépendante qui clive la 5-oxoproline en glutamate dans la réaction suivante:

Cette réaction nécessite l'énergie de l'ATP car la liaison amide de la 5-oxoproline est très stable.

Une dipeptidase (DP) (E.C.3.4.11.2) intracellulaire ou liée à la membrane externe (membrane-alanyl-aminopeptidase) catalyse la dégradation du dipeptide cystéinylglycine dans les réactions suivantes:

Cette enzyme assure la dégradation du L-cystéinylglycine en cystéine et glycine. Ces acides aminés sont alors réintroduits dans le cycle de synthèse des protéines et du glutathion. L'aminopeptidase catalyse également la dégradation de conjugués S-cystéinylglycinylé issus de l'activité des glutathion S-transférases et de la γ-glutamyl transpeptidase.

2.3 Oxydo-réduction du glutathion

2.3.1 Glutathion péroxydases

Les glutathion péroxydases (GPx: EC.1.11.1.9 et EC.1.11.1.12) catalysent la dégradation du péroxyde d'hydrogène (réaction 1) et des hydropéroxydes organiques formés par l'oxydation des acides gras (réactions 2 et 3), en utilisant le glutathion comme donneur d'électrons (Margis et al., 2008).

Chez les animaux, les GPx sont des sélénoprotéines qui varient en fonction de leur spécificité pour les hydropéroxydes (Brown et al., 2000; Herbette et al., 2007). Chez les mammifères, il existe quatre classes majeures de GPx dépendantes du sélénium: GPx1 est retrouvée au niveau du cytoplasme, du noyau et de la mitochondrie, GPx2 est une forme cytosolique, GPx3 est extracellulaire, et GPx4 est liée aux membranes cellulaires où elle catalyse la régénération des hydropéroxydes de phopholipides.

Les GPx[1-3] sont actives sous forme d'homotétramères d'environ 85 kDa tandis que GPx4 l’est sous forme d’un monomère de 22 kDa environ. Deux autres isoenzymes, GPx5 et GPx6, identifiées chez les mammifères, sont proches de GPx3. Toutes ces glutathion péroxydases possèdent un atome de sélénium dans leur site actif, très fortement lié à la chaîne peptidique car incorporé sous forme de sélénocystéine dans la séquence primaire: le soufre de la cystéine est remplacé par le sélénium selon un processus complexe où un codon TGA (codon stop) va permettre l'incorporation de cet acide aminé à un endroit strictement déterminé.

Une autre glutathion péroxydase de phopholipides hydropéroxydés, sans sélénocystéine, a également été identifiée chez les mammifères et constitue la septième isoenzyme. Cette enzyme présente une cystéine dans son site catalytique et joue un rôle important dans l'atténuation du stress oxydant généré par le métabolisme des acides gras polyinsaturés (Utomo et al., 2004).

Les péroxyrédoxines (E.C. 1.11.1.15) sont des protéines capables de réduire le péroxyde d'hydrogène en utilisant le glutathion ou d'autre thiols comme donneur d'électron. Ces enzymes possèdent une cystéine sous forme thiolate (-S^-) à la place de l'atome de sélénium

dans leur site actif, leur permettant ainsi la formation de ponts disulfures. La séquence des réactions est la suivante:

Chez les plantes, les glutathion péroxydases sont des péroxyrédoxines qui se régénèrent à partir des thiorédoxines au lieu d'utiliser le glutathion ou les glutarédoxines (Navrot et al., 2006).

2.3.2 Glutathion réductase

Le glutathion oxydé (GSSG), plus justement appelé glutathion disulfure, est réduit en GSH par l'action de la glutathion réductase (GR, E.C.1.8.1.7) en utilisant le pouvoir réducteur du NADPH, lors de la réaction suivante:

Cette réaction est irréversible, ce qui explique pourquoi le glutathion disulfure, GSSG, constitue généralement moins de 1% du glutathion total. L'augmentation du pool de GSSG au cours d'un stress oxydant est généralement transitoire tant l'action des glutathion réductases est rapide.

Les glutathion réductases sont également impliquées dans la régénération du GSH oxydé par l'activité du couple dehydro-ascorbate réductase (DHAR) / ascorbate péroxydase (APx) dans une suite de réactions qui permet de réduire le péroxyde d'hydrogène:

La concentration cellulaire en GSSG est également régulée par des transporteurs ATP-dépendants qui déplacent le glutathion disulfure vers le milieu extracellulaire (Suzuki and Sugiyama, 1998). Au cours d'un stress oxydant, le GSH est rapidement utilisé, entraînant une augmentation du pool de GSSG. Dans ces conditions, un pont disulfure peut être formé entre le glutathion disulfure et le groupement sulfhydryle d'une protéine, produisant alors une protéine S-glutathionylée (Dalle-Donne et al., 2007):

La glutathionylation des protéines est une modification post-traductionnelle des résidus cystéine qui engagent un pont disulfure avec le groupement thiol du glutathion (Ghezzi and Di Simplicio, 2007). Ce processus est généralement associé au stress engendré par les espèces activées de l'oxygène et par l'oxyde nitrique, mais apparaît également dans des conditions cellulaires normales (Townsend, 2007). La glutathionylation des protéines semble jouer un rôle dans la médiation des signaux cellulaires au même titre que la phosphorylation, et les glutarédoxines sont les acteurs de la dé-glutathionylation (Shelton et al., 2005).

L'état réduit des cystéines libres des protéines est généralement la cible des espèces activées de l'oxygène qui génèrent alors la formation de ponts disulfures non spécifiques. L'état rédox des protéines est contrôlé par l'action des glutarédoxines (Grx) et des thiorédoxines (Trx) dans le système suivant:

Un taux élevé de glutathion réduit est nécessaire pour l'activité des protéines afin d'éviter la formation de ponts disulfures non spécifiques qui engendrent l'agrégation et l'inactivation des protéines. Les cystéines des protéines sont maintenus à l'état réduit P(SH)2 par l'oxydation du groupement thiol des thiorédoxines d'une part et des glutarédoxines d'autre part. Les thiorédoxines sont maintenues à l'état réduit par l'activité NADPH dépendante des thiorédoxines réductases (TR). Les glutarédoxines sont maintenues à l'état réduit grâce au glutathion réduit, oxydé en glutathion disulfure, et à nouveau réduit par l'activité des glutathion réductases (GR).