1.1 La recherche de marqueurs moléculaire du stress chez les algues
Afin d'identifier et de caractériser des gènes impliqués dans la réponse aux stress chez l'algue brune L. digitata, une banque de 1985 EST a été générée à partir de protoplastes (Roeder et al., 2005). Cette banque, comparée à une banque d'EST générée à partir de sporophytes (Crépineau, 2000) a permis d'établir que les gènes de réponse au stress étaient plus exprimés chez les protoplastes.
Parmi les dix gènes les plus exprimés dans cette banque, les auteurs ont identifié un gène de glutathion S-transférase cytosolique, représenté par 21 séquences. Cette forte représentation suggère un rôle important de ce gène de GST dans la réponse aux stress imposés aux protoplastes. De plus, trois autres gènes de GST cytosoliques ont été identifiés, auxquels correspondent dix, six et quatre EST. Ainsi, 41 séquences parmi les 1985 que compte la banque, soit 2%, codent pour des GST. La recherche d'homologues par blast dans les banques de données a montré que les GST les plus proches des gènes d'algues brunes appartiennent à la classe Sigma (~30% d'identité).
Une approche similaire a été entreprise chez l'algue rouge C. crispus, et 2002 EST de protoplastes et 2052 EST de thalle ont été obtenues (Collén et al., 2006). Parmi les gènes moyennement à fortement exprimés dans le protoplaste, les auteurs ont identifié trois GST cytosoliques, représentée par 41, 12 et 2 EST, suggérant un rôle de ces enzyme dans la réponse aux stress chez l'algue rouge. Les plus proches homologues de ces GST appartiennent, comme pour L. digitata, à la classe Sigma (~30% d'identité).
Ces deux études successives ont donc montré que chez les macroalgues rouges et brunes, l'expression des gènes de GST est induite au cours du stress généré par la formation de protoplastes. Elles suggèrent également que les GST d'algues brunes et rouges appartiennent à une classe que l'on supposait spécifique des métazoaires, faisant ainsi des GST d'algues les premières enzymes d'organismes photosynthétiques qui appartiendraient à la classe Sigma.
1.2 Caractérisation des GST de C. crispus
Au cours de sa thèse, Cécile Hervé a, entre autre, caractérisé les GST de C. crispus afin d'en évaluer leurs rôles dans la réponse au stress (Hervé, 2006). Chez cette algue, les trois GST cytosoliques ont été nommées CcGST1, CcGST2 et CcGST3. CcGST[1-2] partagent 52 % d'identité entre-elles et environ 30% avec des protéines de la classe Sigma. La structure des gènes établis par comparaison des séquences génomiques et d'ADNc fait apparaître un seul intron et deux exons. Le troisième gène, CcGST3, n'est pas affilié à une classe existante de GST et présente une structure génique sans intron.
En réalisant une étude phylogénétique pour déterminer la classe des GST identifiées dans les protoplastes d'algue rouge, C. Hervé a mis en évidence qu'elles formaient un cluster spécifique des macroalgues et pouvait constituer une nouvelle classe, proche des Sigma.
Des profils d'expression des gènes de GST en conditions de stress ont été déterminés et les trois GST présentent une forte induction en réponse à un traitement par des oxylipines, notamment le méthyle jasmonate, qui induit la synthèse de prostaglandines chez cette algue. Certains herbicides induisent également l'expression de gène, tandis que la présence de métaux lourds n'a pas d'effet.
Afin d'identifier des substrats pour ces enzymes, les protéines CcGST1 et CcGST2 ont été surexprimées et purifiées. Une gamme de substrats généralistes des GST a été testée et a permis de déterminer certains paramètres enzymatiques et d'identifier des inhibiteurs. Les GST de C. crispus sont dotées d'une capacité de conjugaison du GSH sur le CDNB, les dérivés du dinitrobenzène, et l'aldéhyde 4-HNE. Elles présentent également une activité péroxydase sur le cumène hydropéroxide, le t-butylhydropéroxyde et les hydropéroxydes 13-HpOTE et 13-HpODE. Le Cibacron Blue s'est révélé être un inhibiteur très fort de l'activité transférase en agissant à des concentrations de l'ordre du micromolaire.
Faisant l'hypothèse du rôle des GST de C. crispus dans la synthèse des prostaglandines, Cécile Hervé a mesuré, par LC-MS, la synthèse de prostaglandines dans des extraits protéiques de C. crispus incubés avec différents inhibiteurs puis traitées pendant 45 minutes avec de l'acide arachidonique (Figure 40).
PGA2 PGB2 11-deoxy-PGE2 V ar ia ti o n p ar r ap p o rt a u c o n tr ô le ( % ) -100 -80 -60 -40 -20 0 20 Acide salicylique 1mM Indométhacine 600 µM Cibacron Blue 0,5 µM
Figure 40: Inhibition de la synthèse des prostaglandines chez C. crispus dans des extraits protéiques incubés en présence d'acide arachidonique, d'après (Hervé et al., 2007).
Les résultats montrent que la synthèse de PGA2, PGB2 et 11-deoxy-PGE2 est inhibée par le Cibacron Blue, inhibiteur des GST. En revanche, la synthèse de PGA2, PGB2 n'est pas modifiée par l'acide salicylique et l'indométhacine, tous deux inhibiteurs des cyclooxygénases. Ceci tend donc à prouver que les cyclooxygénases ne sont pas impliquées dans la synthèse de certaines PG, alors que les GST ont un rôle dans la synthèse des prostaglandines chez l'algue rouge C. crispus. Ces résultats sont à prendre avec précautions car ils ont été obtenus à partir d'un extrait protéique total et non sur des GST pures.
1.3 L'accès à des bases de données
Au sein du Service Informatique et Génomique (SIG) de la Station Biologique de Roscoff, Erwan Corre a mis en place une plateforme d'accès à différentes banques de séquences privées de macroalgues et de microalgues. Ainsi, il est possible d'effectuer des recherches par blast sur des banques d'EST d'algues rouges Chondrus crispus, Porphyra
yesoensis, Cyanidioschyzon, Gracilaria gracilis, Gracilaria changii, Gracilaria lemaneiformis, d'algues brunes Laminaria digitata, Laminaria japonica, Fucus distichus, Fucus serratus, Fucus vesiculosus, Sargassum binderi, Fragilariopsis cylindrus, Phaeodactylum tricornutum, et d'algues vertes Ostreococcus tauri et Ulva linza.