PUCES A ADN

L’utilisation de puces à ADN, ou « microarrays », permet l’analyse du transcriptome à grande échelle dans le but d’identifier et de quantifier les produits de l’expression des gènes des cellules d’un tissu à un instant et dans un environnement donné. Ceci permet de comparer différents états biologiques par identification et quantification de la surexpression ou de la répression de ces gènes.

3.7.1. Principe

Une puce à ADN, appelé aussi chip ou microarray, est un ensemble de molécules d’ADN fixées en rangées ordonnées sur une surface lisse qui peut être du verre, du silicium ou du plastique. Le principe d’une puce à ADN repose sur la capacité de l’ADN dénaturé à reformer une molécule d’ADN double brin lorsqu’il est en présence de son brin complémentaire : la réaction d’hybridation. Les ARNs totaux extraits à partir de cellules d’un tissu donné sont transformés en ADNc par rétrotranscription en incorporant un marqueur qui permet de lier un colorant : le Cyanine 3 (vert) ou le Cyanine 5 (rouge). Cette transformation en ADNc ne concerne que les ARNm. Pour comparer le transcriptome exprimé entre une condition A et une condition B, il suffit, par exemple, de marquer les ADNc de la condition A en vert et les ADNc de la condition B en rouge. Les ADNc sont alors déposés en condition dénaturante sur la lame de verre qui arbore à sa surface l’ensemble du transcriptome connu

d’une espèce donnée. Les molécules complémentaires d’ADNc monobrins s’hybrident entre brins complémentaires pour reformer une molécule d’ADN à double hélice. Des milliers de fragments, appelés aussi sondes, peuvent se lier sur une même puce à ADN. En fonction de la coloration (vert, jaune et rouge), il est possible de déterminer le niveau d’expression du transcriptome pour chaque gène à une condition donnée en comparaison à une autre condition (ex : vert : répression ; jaune : aucun changement d’expression ; rouge : surexpression). Lorsque les gènes en surexpression et répression sont identifiés grâce aux puces à ADN, leurs niveaux d’expression peuvent être estimés par RT-PCR en temps réel. En effet, il est très difficile de quantifier l’expression d’un gène par microarrays. Les puces à ADN fournissent une information qualitative sur un large spectre, puis, cette information doit ensuite être vérifiée sur une série de gènes candidats par une technique quantitative : la RT-PCR en temps réel.

3.7.2. Méthodologie

Les ARNs totaux utilisés pour cette étude sur l’expression du transcriptôme par puces à ADN ont été extraits à partir de feuilles prélevées au dernier jour du déficit hydrique de l’expérience 4 (cf Tab.10) et de feuilles de Lime Rangpur autotétraploïde et diploïde en condition témoin. Les puces à ADN utilisées pour cette étude ont été élaborées par le « Spanish Citrus Functional Genomics Project » et contiennent 21081 sondes (Martinez-Godoy et al., 2008).

● Préparation des échantillons

Une synthèse d’ADNc (ADNc*), marqué par incorporation de dNTP lié à un aminoallyl dUTP, a été réalisée à partir d’ARN purifié. Pour 15 µ L de chaque échantillon d’une concentration de 2 µg.µ L^-1 a été ajouté 3 µL d’oligo dt de même concentration. Le tout a été mis à incubation durant 10 min à 70°C. La solution réactionnelle de la Reverse Transcriptase (SuperScript II, Kit Invitrogen), à laquelle fut ajouté le dNTP marqué à l’aminoallyl dUTP, a été additionnée aux échantillons ainsi préparés. L’ensemble a été laissé toute une nuit à 42°C afin que la réaction de synthèse puisse s’accomplir. L’hydrolyse de l’ARN restant a été effectuée par incubation à 65°C durant 15 min après l’ajout de 10 µL de NaOH 1M et 10 µ L d’EDTA 0,5M. Après incubation, 10 µ L de HCl 1M a été rajouté afin de neutraliser le changement de pH induit par le NaOH, permettant ainsi la purification des ADN_c* synthétisés (Kit Invitek 10202203).

Les ADN_c* purifiés ont été séchés, puis re-suspendus dans une solution comprenant 9 µ L de Na₂CO₃ à 100 mM pH 8,5-9 et 4 µL de fluorochrome. Chaque échantillon a été marqué par un des deux fluorochromes, le Cy3 ou le Cy5, de telle sorte que des paires d’échantillons contrôle/stressé puissent êtres marqués de façon complémentaire. Ainsi, un échantillon contrôle marqué au Cy3 a été associé à un échantillon stressé marqué au Cy5, et vice et versa. Le fluorochrome se fixe à l’ADNc* par le dNTP marqué à l’aminoallyl dUTP après une incubation de 1 à 3 heures à température ambiante et à l’abri de toute lumière. Une nouvelle purification (Kit Invitek 10202203) de l’ADNc* marqué aux fluorochromes a été réalisée après neutralisation du pH par l’ajout de 40 µ L d’acétate de Na⁺ 100 mM pH 5-5,2. Le taux d’incorporation du fluorochrome à son ADNc* a été estimé pour chaque échantillon (NanoDrop/® /ND/-1000). En fonction du nombre de pmol.µ L^-1 déterminé, la quantité totale de pmol par échantillon a été évaluée. Il est nécessaire d’obtenir au moins 100 pmol par échantillon.

Chaque échantillon en condition contrôle et marqué avec un fluorochrome donné (ex : Cy3) a été uni à un échantillon en condition stressé et marqué avec le fluorochrome opposé (ex : Cy5) pour une quantité de pmol identique. Les échantillons contrôle/stressé assemblés ont alors été déshydratés et entreposés à -80°C en attendant leur hybridation aux puces à ADN.

● Préparation des puces à ADN et hybridation

Les spots d’ADN ont été humidifiés à la vapeur et séchés afin de les stabiliser sur leur support. L’ADN a ensuite été immobilisé par exposition à un rayonnement ultra violet (U.V.Crosslinker, 150 mJoules/cm²). Les puces à ADN ont été mises à tremper dans leur solution de préhydridation (SSC 3x, SDS 0,1%, BSA 0,1mg/mL) 1 heure à 50°C. Après incubation, les puces ont été lavées successivement 5 min dans 2 solutions de lavage SSC (0,1x) et 30 s dans de l’eau ultra pure. Enfin, les puces ont été séchées par centrifugation.

L’ADNc*Cy3/Cy5 a été re-suspendu dans 60 µ L de solution d’hybridation (SSC 3x, SDS 0,1%, ADN sp. Saumon 0,1mg/mL), puis incubé 5 min à 95°C. Une fine plaque de verre, préalablement passée par différents bains (SDS 0,5%, eau ultra pure, éthanol 96%, eau ultra pure) et séchée par centrifugation, a alors été ajustée sur la puce. Les 60 µ L de solution d’hybridation associé à l’ADNc*Cy3/Cy5 ont été injectés par capillarité entre la puce et la fine plaque de verre. L’ensemble, transféré dans une chambre étanche, a été placé dans un bain marie à 50°C toute une nuit.

● Lavages et imagerie

Les puces ont été retirées de leurs chambres étanches et directement placées dans un bain de SSC 2x + SDS 0,1% à 42°C afin de détacher la lamelle de verre. Les puces ont alors été transférées dans un nouveau bain de SSC 2x + SDS 0,1% et mises à incubation à 42°C avec rotation. Enfin, après différents bains successifs (2 bains successifs de 5 min au SSC 0,1x + SDS 0,1% à 28°C, puis 5 bains successifs de 1 min au SSC 0,1x à 28°C et un dernier lavage de 30 s à l’eau ultra pure), les puces ont été séchées par centrifugation.

L’image de la puce à ADN ainsi préparée a été révélée au scanner (Perkinelmer, ScanArrays Gx) et traitée (Programme Scan Arrays Express) (cf Figure 13). Les données ont alors été analysées par le programme GenePix Pro 6.0. Les résultats obtenus ont été avalisés après traitement statistique par le logiciel R (Forment et al., 2005).

Figure 13 : Résultat d’hybridation sur puce ADNc 20K Citrus