P.C.R. EN TEMPS REEL

La PCR en temps réel est essentielle pour valider les résultats des analyses par puces à ADN. Que ce soit de façon relative par comparaison d’états biologique, ou que ce soit de façon absolue par numération du nombre de copies du messager, elle permet de mesurer précisément le niveau d’expression d’un gène d’intérêt au sein d’un type cellulaire placé dans différentes situations physiologiques. Ainsi, les résultats des profils d’expression obtenus par puces à ADN sur feuille ont été confirmés par une étude d’expression par RT-PCR en temps réel (une phase de Reverse Transcriptase précédent la PCR en temps réel). Une série de gène,

surexprimée comme réprimée, a été sélectionnée à cet effet. Cette validation de l’analyse par puces à ADN à partir d’échantillons foliaires a été complétée par une étude d’expression par RT-PCR en temps réel réalisée à partir d’échantillons de racines.

3.8.1. Principe

La PCR en temps réel est basée sur la détection et la quantification d’un marqueur fluorescent, dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés durant la réaction PCR. Les données quantitatives sont recueillies pour chaque échantillon lors de la phase exponentielle de la PCR. Ainsi, la PCR en temps réel enregistre l’émission de fluorescence d’un indicateur de la production d’amplicons à chaque cycle de la PCR, et, la première augmentation significative de la quantité d’amplicons détectée se trouve alors en corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice originale cible. Cette augmentation est significative quand l’émission de fluorescence est statistiquement et significativement supérieure au bruit de fond. Le cycle PCR pour lequel est enregistré cet évènement qui amorce la phase exponentielle d’amplification est appelé « cycle seuil ». Plus le nombre de cycle requis pour atteindre le cycle seuil est faible et plus la quantité de matrice de départ est importante (Gibson et al., 1996). La valeur de cycle seuil obtenu est alors converti en un résultat quantitatif par comparaison avec des valeurs du cycle seuil générées à l’aide de matrices de quantification connues (Bustin, 2000).

Deux types de marquage des amplicons existent : les agents intercalant se liant à l’ADN double brin, comme le SYBR green I, et les sondes fluorescentes. Dans cette étude, le SYBR green I (Morrison et al., 1998) a été préféré à l’utilisation des sondes fluorescentes pour des aspects économiques et de facilités d’utilisation. Il a de plus l’avantage d’être plus sensible que le bromure d’éthidium et de ne pas inhiber la réaction d’amplification de la PCR. Libre en solution, le SYBR green I émet peu de fluorescence, mais celle-ci augmente considérablement lorsqu’il se lie à l’ADN double brin en formation. L’incorporation du SYBR green I dépend de la spécificité de liaison des amorces au brin matrice et est indépendante des mutations éventuelles de l’ADN cible qui influe sur le taux d’incorporation des sondes fluorescentes (Bustin 2000, Mackay et al., 2002). Cependant, comme la liaison du SYBR green I à l’ADN n’est pas seulement spécifique à l’amplifia, il peut survenir des faux positifs, et une surestimation de la quantification suite à de mauvais appariements des amorces d’amplification est également possible (Bustin, 2000).

3.8.2. Méthodologie

Les ARNs totaux utilisés pour la réalisation de RT-PCR en temps réel ont été extraits à partir de feuilles et de racines prélevées au dernier jour du déficit hydrique de l’expérience 3 et 4 (cf Tableaux 10 et 11) et de feuilles de lime Rangpur autotétraploïde et diploïde en condition témoin.

● Préparation des échantillons

Les ARNs totaux ont été extraits à partir de feuilles et de racines, puis purifiés (Kit Marligen Biosciences, INC Rapid PCR Purification Systems) et quantifiés au NanoDrop (NanoDrop/® /ND/-1000). Afin d’éliminer les traces d’ADN résiduelles, les échantillons ont subi un traitement DNAse I (Fermentas EN0523) : dans un volume total de 100 µL, 10 µ L de tampon et 2 µ L de DNAse I à 25 u. ont été ajouté pour 100 µg d’ARN totaux. L’ensemble a été placé à incubation à 37°C de 15 à 20 minutes, puis purifié et quantifié à nouveau. Les ARNs totaux traités à la DNAse I ont alors été dilués à une concentration identique pour tous les échantillons de 75 ng.µ L^-1 à +/- 15 ng.µ L^-1.

● Définition des couples d’amorces

Tous les couples d’amorces ont été définis à partir de la banque EST d’agrume de l’IVIA. Les gènes cibles sont ceux caractérisés en surexpression et en répression par puces à ADN (cf Tableaux 12 et 13). Les couples d’amorces ont été définis à l’aide du logiciel Oligoexplorer (Disponible sur : http://www.genelink.com/tools/gl-oe.asp) paramétré comme suit : Tm = 55°C ; taille des amorces = 19 à 20 pb ; taille du produit d’amplification = 100 à 120 pb ; % de GC entre 45% et 55%.

Tableau 12 : Liste des amorces nucléaires utilisées dans l’étude du transcriptome entre la

lime Rangpur diploïde et autotétraploïde (cf Art.3) par PCR en temps réel. Gène N° Accession Séquence Sondes (5’-3’)

Cdc2K IC0AAA65AG07 ^{F: GTGGGTCTCCTGATGAAACC} _{R: AGCATGTCGGTCAAAGTGTC}

H1F KN0AAH1DF06 ^{F: ACCCTCCTTACTCTGAGATG} R: GGAGACTAGCCTTCTGTTTC

Px63 IC0AAA24AF10 ^{F: AAAAGCCGCTGATGTTGAAG} R: CCACTCAGAGCCACCATTTC

lhca2 IC0AAA41DB10 ^{F: TGAGACGCTGAGATGGAAC} R: GGATGGAGTGTTGAGGATTC

PC IC0AAA26DC03 ^{F: TGTTCCAAGCTCTTTCTCTG} R: CACCACTCGGAATCTCATC

CCR IC0AAA41DF01 ^{F: GAAACTGTGTGCTTACATCG} R: ATTCGTCACTCCAGGATTC

Tableau 13 : Liste des amorces nucléaires utilisées dans l’étude de l’expression génique par

RT-PCR en temps réel chez le cédratier (cf Table 3, Art.4) et l’oranger greffé sur la lime Rangpur diploïde et autotétraploïde (cf Table 4, Art.3 et Table 1, Art.5).

Gène N° Accession Séquence Sondes (5’-3’)

DH C31207C07 ^{F: GCCACCGAGTTTGAGAAAG} R: GTGGATCGGTGAAGTTTGTC P5CS C34107H03 ^{F: CTAGGAAAGCACCATACGAG} R: GAGGCCCTCTACATCACTC RS C05076C10 ^{F: TCGACGTTATCCATTTGCTG} R: CACCATTGCCCTTGAAGTG GolS C31402D06 ^{F: CCATGGCCTATTATGTCATC} R: CATCAGGCAAGTCAAACAG TPS C31403D05 ^{F: AGGGGATGACCGTTCTGATG} R: GCCATGCTCGGTTTCTGAC SOD C31504C12 ^{F: GGAACTGTTTCCTTTAGCG} R: TGCCTATGTTTCCGTAAGTG

DHAR C31402E11 ^{F: AGCCCAGAAGGGAAAGTACC} R: AGGCAAATTCAGGAGGATTG

GST C07010G07 ^{F: AATCGCGAGCTATCATAAGG}

R: CTACTTCCAGCCATTGTTCC

AOX KN0AAP7YK07 ^{F: GCGTAAGTTCCAGCATAGTG} R: CCTCCAAGTAGCCAACAAC ERD4 C01019H06 ^{F: CGCTGCCCTGCTACTGTAC} R: CCATGCTAGGGGTTTCCTTC LEA C34209G11 ^{F: GCGACGGAGAAGAAAGAGG} R: CACCACCCCTTCAATCACC FAE C32009D10 ^{F: GGGGCTTGAAGAATACAGG} R: AATGCCTCAGCTAAAGAAGG CCR C34205C03 ^{F: CCTTGCAAAGACACTATCTG} R: GATTGAGGGTTCTGTTGAG WAX2 C02002B06 ^{F: CTCGATGGAACACAAAAGG} R: AGTGGTAATGGGTGAAAAGG psbW C31604G05 ^{F: CTGTTGGGTGTTTTTGGTC} R: TGGGTTTGGCTTTAGACTTC

psaK C05072A10 ^{F: CGTTGTGGCTTCATTGGTTC} R: CCGTTGCTTTCCTGTTTGC

OEE C31604E09 ^{F: CTCAGGTTCCTTTGTTCAAG}

R: TGGCTCATCAGAGTTCAAC CAO C31601G07 ^{F: TACCTATGGAGGCACTTTG} R: CACCCCTAGTTTGTCGTAAC CA C01015D11 ^{F: CACCAGCTCCTATCATCAAC} R: GCAACAGGTTTCAAGTCTTC PEPC C16013C03 ^{F: CCAAGCCTACACTCTGAAG} R: TAGGGTTAAGCCTCACAAG

● Elaboration des courbes étalons

Une synthèse d’ADNc a été réalisée par Reverse Transcriptase (SuperScript II, Kit Invitrogen) à partir des ARN totaux traités à la DNAse I. 3 µ L l’oligo dt à 2 µg.µ L^-1 a été ajouté pour 20 µg d’ARN total. L’ensemble a été placé à incubation durant 10 minutes à 70°C, puis a été ajouté au mélange réactionnel de la RT (par échantillon : 6 µ L de Tampon

5x, 3 µL de DTT à 0,1 M, 0,6 µ L de dNTP, 0,5 µ L de RNAse OUT et 2 µ L de SuperScript II RT à 200u.µ L^-1). L’ensemble a été à nouveau placé à incubation à 42°C durant toute une nuit.

L’ARN résiduel a été hydrolysé par incubation à 65°C durant 15 minutes après l’ajout de 10 µ L de NaOH à 1 M associé à 10 µ L de EDTA à 0,5 M. Le pH a alors été neutralisé par rajout de 10 µL de HCl à 1 M. Les ADNc ont alors été purifiés (Kit Invitek 10202203) puis quantifiés au NanoDrop (NanoDrop/® /ND/-1000).

Une PCR classique a été réalisée à partir des ADNc préparés et des couples d’amorces définis pour la PCR en temps réel. 2 µL d’ADNc ont été ajoutés au mélange réactionnel de la PCR composé de 5 µ L de tampon 10x, de 2 µ L de dNTP à 10 mM, de 0,5 µ L d’amorce F et R à 50 µM, de 38 µL d’eau milliporée stérile et de 2 µL de Taq polymérase. Le thermocycleur était programmé comme suit : 94°C durant 2 minutes, puis 30 cycles à 94°C durant 30 secondes, 55°C durant 30 secondes également et 72°C durant 1 minute, puis, au final, 10 minutes à 72°C.

La moitié du produit PCR a été récupérée pour effectuer une migration sur gel d’agarose à 2% par électrophorèse afin de vérifier la spécificité et la qualité d’amplification des amorces définies. La seconde moitié du produit PCR a été diluée au 1/1000^e, puis, à partir de cette dilution, une gamme de dilution de 10 en 10 a été réalisée de 10^-1 jusqu’à 10^-8. Pour chaque gène étudié, cette gamme de dilution représente une gamme standard utilisée en PCR en temps réel. En effet, une valeur de cycle seuil est obtenue pour chaque dilution, ce qui permet l’élaboration d’une courbe étalon pour chaque gène. La spécificité d’amplification est vérifiée si les courbes de fusion, qui correspondent à des pics de fluorescence proportionnels de l’état d’hybridation du produit PCR atteint au T_m, se superposent pour chaque dilution. Ainsi, les valeurs de cycle seuil recueillies de chaque échantillon ont put être quantifié par report sur la courbe étalon du gène étudié.

● Quantification relative par RT-PCR en temps réel

Pour chaque gène étudié, une dilution ayant permis d’élaborer la courbe étalon est utilisée en tant que référent avec les échantillons. Chaque quantification est moyennée sur une réplication biologique pour une condition donnée.

A 2,5 µ L d’ARN totaux à 75 µg.µ L^-1 a été ajouté le mélange réactionnel de RT-PCR en temps réel (LightCycler FastStart DNA Master^PLUS SYBR Green I) composé comme suit par échantillon : 4 µL d’eau, 2 µ L de Master 1 (LightCycler FastStart DNA Master^PLUS SYBR Green I), 0,1 µ L de reverse transcriptase MultiScribe (Applied Biosystems), 0,2 µ L de RNAse OUT (Applied Biosystems), 0,6 µ L d’amorces F et R à 5 µM. L’ensemble a été placé

en capillaires (LightCycler capillaries (20µ L)) adaptés au « LightCycler 2.0 instrument » (Roche, Diagnostics GmbH, Allemagne). Le « LightCycler 2.0 instrument » était programmé comme suit : premièrement, une phase de rétrotranscription à 48°C durant 30 minutes, deuxièmement, une phase de PCR (10 minutes de dénaturation à 95°C, 45x( 2 secondes de dénaturation à 95°C, 10 secondes d’hybridation à 55°C (Tm), 15 secondes d’élongation à 72°C) et troisièmement, une phase d’augmentation de température jusqu’à 95°C à 0,1°C.s^-1).