Puces à ADN

Lors de l’évaluation d’une nouvelle molécule thérapeutique chez un modèle animal, la mesure de différents paramètres biologiques (ex : glycémie dans le cadre du diabète de type 2) permet d’étudier l’efficacité d’un composé. Ce type de mesure ne permet néanmoins pas de comprendre le mode d’action de la molécule testée. Dans le cadre de la recherche d’agonistes SPPARM, on souhaite essentiellement montrer que le mode d’action du composé testé est différent de celui d’un agoniste PPARγ complet. C’est dans cette optique que des mesures d’expression des gènes sur puces à ADN ont été réalisées pour l’ensemble du transcriptome de la souris.

1.4.1 Principe des puces à ADN

Les puces à ADN [25] permettent de mesurer simultanément le niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes dans un échantillon biologique, c’est-à-dire les ARNs messagers. Ce sont des lames sur lesquelles sont fixées des sondes d’ADN. Les ARNs messagers d’un échantillon biologique, préalablement extraits, amplifiés et marqués, sont hybridés sur la lame. Chaque séquence d’ARN messager se fixe alors sur la sonde complémentaire correspondante. La lame est ensuite lue par un scanner et les résultats sont analysés pour

fournir le niveau d’expression de chaque gène d’intérêt. Ces informations sont habituellement exploitées par la comparaison des profils d’expression géniques entre différentes conditions biologiques.

Il existe différents types de lames et de protocoles. Une lame de puce à ADN est un support solide de quelques centimètres carrés sur laquelle sont fixées des sondes pouvant être de deux natures différentes. Ce sont soit de longues séquences d’ADN complémentaire (500 à 5000 bases) qui ont été déposées sur la lame mais sont de moins en moins utilisées, soit des oligonucléotides plus courts (20 à 80 bases) déposés sur la lame ou synthétisés in situ. L’approche de mesure de l’expression des gènes en puces à ADN peut être directe ou différentielle. Dans la version directe, un seul échantillon biologique est hybridé sur la lame et mesuré. Les résultats obtenus ne sont pas quantitatifs car toutes les sondes ne fixent pas de la même manière leur séquence complémentaire. L’analyse différentielle consiste à hybrider sur la même lame un échantillon contrôle de référence mélangé à l’échantillon à tester, chacun marqué par un fluorochrome différent. Ce type d’approche permet de s’affranchir des différences d’affinité des sondes.

1.4.2 Technologie Agilent utilisée

1.4.2.1 Caractéristiques des lames Agilent

Les puces à ADN utilisées pour les expériences étudiées sont des puces à oligonucléotides (60 bases) commercialisées par la société Agilent. Les lames sont des lames de souris 4*44k [26], c’est-à-dire que chaque lame comporte environ 4*44000 sondes permettant de mesurer simultanément l’expression de tout le génome de la souris pour 4 échantillons biologiques (pattern ID 014868).

FIG. 1.3 : Différents niveaux de reconnaissance des séquences d’ARN [27]

Un feature est un spot sur lequel sont adsorbées plusieurs sondes identiques (reporter). Le même reporter peut être adsorbé sur différents features. Plusieurs reporters différents peuvent reconnaître la

Chaque spot de la lame, ou feature, est constitué d’un ensemble de sondes identiques (reporters ou oligonucléotides) qui permettent le dosage des ARNs complémentaires. Plusieurs features peuvent correspondre au même reporter, plusieurs reporters différents peuvent doser la même séquence d’ARN et plusieurs séquences peuvent correspondre au même gène (transcrits différents). Ceci est illustré sur la Figure 1.3.

1.4.2.2 Analyse différentielle

Une analyse différentielle est utilisée et le protocole expérimental représenté sur la Figure 1.4 est le suivant. Les ARNs sont extraits pour les animaux témoins et traités. Les échantillons d’ARN des animaux témoins sont mélangés pour constituer un échantillon contrôle. Ces ARNs sont amplifiés et marqués à la Cyanine 3 (cf Annexe A pour le détail de l’amplification et du marquage). Les échantillons d’ARN des animaux traités sont amplifiés et marqués à la Cyanine 5. Chaque échantillon d’un animal traité est mélangé avec l’échantillon contrôle, puis hybridé sur une puce à oligonucléotides Agilent.

Puce à oligonucléotides Marquage

+ Amplification Extraction d’ARN

Animaux témoins Animal traité

ARN témoin _{ARN traité}

FIG. 1.4 : Protocole expérimental d’analyse différentielle

Les ARNs des animaux témoins sont regroupés et marqués à la Cyanine 3. L’ARN d’un animal traité est marqué à la Cyanine 5. Les deux échantillons sont mélangés, puis hybridés sur une puce à

Après l’hybridation, les lames sont lavées puis lues par un scanner. La Cyanine 3 (Cy3) apparaît en vert et la Cyanine 5 (Cy5) en rouge. La couleur de chaque spot informe sur la différence d’expression entre témoin et traité pour le feature correspondant (Figure 1.5) :

- spot apparaissant en noir : pas d’expression

- spot apparaissant en jaune : expression similaire chez le témoin et le traité

- spot apparaissant en vert (Cy3) : sous-expression chez le traité par rapport au témoin - spot apparaissant en rouge (Cy5) : sur-expression chez le traité par rapport au témoin

FIG. 1.5 : Image scannée d’une puce à ADN

Un logiciel de traitement d’image (Feature Extraction, Agilent) extrait les données à partir de l’image scannée : intensités des canaux Cy3 et Cy5, mesure d’erreur, rapport d’expression entre témoin et traité, significativité de la différence d’expression, … Différents biais expérimentaux ou techniques peuvent intervenir au cours du processus : petites différences dans les quantités initiales d’ARN, déséquilibre entre les fluorochromes en terme de propriétés physiques (capacité d’incorporation à l’ARN, sensibilité à la lumière, demi-vie), limites techniques du scanner, hybridation non uniforme, marques de lavage, … C’est pourquoi le logiciel d’extraction procède à certains ajustements par rapport aux intensités brutes relevées.

1.4.2.3 Procédure de dye-swap

Une procédure appelée dye-swap (inversion des colorants : Figure 1.6) est utilisée afin de corriger en partie le biais lié aux différences entre les deux fluorochromes (Cy3 et Cy5). Chaque hybridation est réalisée deux fois : la première en appliquant les marquages cités précédemment et la seconde en inversant les fluorochromes entre échantillons témoins et traités. Les résultats sont ensuite combinés à l’aide d’un autre logiciel (Rosetta Resolver) pour obtenir un seul jeu de données par animal.

ARN témoin marqué Cy3 ARN traité marqué Cy5 ARN témoin marqué Cy5 ARN traité marqué Cy3 Hybridation

Jeu de données

pour un animal

Combinaison des résultats

FIG. 1.6 : Procédure de dye-swap Cy3 : Cyanine 3, Cy5 : Cyanine 5