Chapitre IV : Développement et validation d’une méthode de dosage des principaux
2. Protocole de la validation de la méthode de dosage des métabolites de l’albendazole par
Pour valider la méthode de dosage des métabolites de l’albendazole par CLHP nous avons proposé un protocole de validation en nous basant sur les critères de l’ICH-Q2(R1) [131].
2.1 Standards :
L’Albendazole a été obtenu à partir de Mercure Pharmaceutical Ltd, Vadodara (Inde) et le mébendazole de Research Chemicals Inc Toronto (Toronto, Canada).
Le sulfoxyde de l’albendazole (ABZSO), le sulfone de l'albendazole (ABZSO2) d'une pureté de 97-99% et ont été synthétisés dans le laboratoire de chimie thérapeutique de la faculté de médecine et de pharmacie-Rabat.
L'acétate d'ammonium (grade CLHP) était de Fluka d’une pureté de 99,7%.
L'acétate d'éthyle (pureté 99,5%) était de Solvachim et tous les autres produits chimiques étaient de qualité CLHP de chez Sigma Aldrish.
Les échantillons de plasma humain ont été fournis par le « Centre national de transfusion sanguine – Rabat - Maroc », et conservés congelés en aliquotes à - 20 °C.
2.2 Appareillages :
L'analyse des échantillons a été menée sur une chromatographie liquide à haute performance HPLC (Waters2695, États-Unis), couplée à un détecteur ultraviolet (Photodiode Array
detector 2996) opérant à une longueur d’onde fixée à 295nm et piloté par un logiciel Pro2 Empower intégrateur.
2.3 Conditions chromatographiques :
La phase mobile est composée de l’acétonitrile (30%) et d’un tampon phosphate (contenant 0,025M du dihydrogéne phosphate d'ammonium, pH=5) à 70%, elle a été filtrée à travers un filtre Millipore TM Durapore de 0.45 µm et dégazée sous vide avant utilisation. L'élution a été effectuée à un débit de 1,2 ml/min en mode isocratique et le volume d'injection était de 50µl à une température de 5°C du passeur d’échatillon.
La séparation chromatographique a été réalisée sur une colonne thermohypersil ODS C18 en phase inverse, (250 × 4.6 mm, 5µm), maintenu à 25 ◦C.
2.4 Préparation des solutions standards:
Des solutions stocks d’ABZSO et d’ABZSO2 de [100µg/ml] ont été préparées dans du méthanol. Ensuite, des dilutions successives ont été réalisées en vue d’obtenir plusieurs solutions filles à des concentrations allant de 20, 5, 1, 0.5, à 0.1 µg/ml pour chaque métabolite de l’Albendazole. Ces solutions ont été mélangées et traitées par ultrasons pendant 10 minutes.
Le mébendazole appartenant à la famille de l’albendazole a été choisi comme étalon interne (IS). Séparément une solution stock de mébendazole (MEB) a également été préparée à une concentration de [500µg/ml], puis diluée dans du méthanol à [50µg/ml]. Cette solution a servi pour doper les échantillons de plasma. Toutes les solutions ont été stockées à 4°C.
2.5 Procédure d'extraction :
Afin d’extraire les deux métabolites de l’albendazole (ABZSO, ABZSO2) et l’étalon interne (Mébendazole) avec un bon rendement et sans aucun effet de matrice, une extraction liquide-liquide simple et rapide a été développée après plusieurs phases d’optimisation.
Après décongélation des échantillons du plasma à température ambiante, un volume de 800μl de plasma a été transféré dans un tube en verre de 15 ml et dopé avec 100µl de solution de mébendazole comme étalon interne [50µg/ml]. Après les avoir mixés en vortex, 100 µl des
solutions filles [20, 5, 1, 0,5, 0,1 µg/ml] pour chaque métabolite (ABZSO, ABZSO2) ont été ajoutés.
L’extraction a été réalisée par addition de 3,6 ml d'acétate d'éthyle comme solvant d'extraction. Ensuite, les tubes ont été bouchés, et mis sous agitation horizontalement pendant 20 minutes, puis centrifugés pendant 10 min à 2000 rpm afin de séparer les deux phases, Les phases organiques ont été transférées dans des tubes propres et le solvant a été évaporé à sec dans un concentrateur d’échantillons sous un courant d'azote à 55 ◦C. Les résidus ont été dissous dans 1ml de phase mobile, puis un volume de 50 µl de chaque échantillon a été injecté sur chromatographie.
Le rendement de l'extraction des métabolites analysés (ABZSO, ABZSO2 et le mébendazole) a été déterminé par comparaison de l’aire de pic obtenu après extraction d'échantillons de plasma enrichis, avec l’aire du pic découlant d’injection directe des quantités équivalentes de solutions standards. Le taux de récupération a été calculé en utilisant l'équation suivante :
% de Récupération = Aire du pic de l'échantillon extrait du plasma / Aire de pic de la
solution standard sans extraction ×100 [132].
2.6 Procédure de validation :
La validation de la méthode de dosage des métabolites de l’albendazole dans le plasma a été réalisée selon les récentes lignes directrices internationales pour la validation bio-analytique (les critères de l’ICH-Q2(R1)), qui imposent une caractérisation précise des critères de la méthode : sélectivité, spécificité, exactitude, précision, linéarité, seuils de quantification et de détection.
Ces paramètres ont tous été déterminés :
Spécificité: La spécificité de la méthode a été déterminée en comparant les chromatogrammes des échantillons du blanc de plasma avec ceux dopés avec des solutions standards, afin de démontrer la capacité de la méthode à mesurer les analytes en présence de composés endogènes.
Linéarité : La linéarité de la méthode a été évaluée par la construction des courbes d'étalonnage suite à des dilutions successives des solutions filles pour atteindre 5 niveaux de concentrations couvrant le domaine de calibration pour chaque métabolite
(0.01-0.05-0.1- 0,5 à 2 µg/ml). Chaque niveau a été répété deux fois pour trois séries d'analyse (n = 3). Au total, 3 (séries) x 5 (niveaux) x 2(répétitions) = 30 solutions standards ont été préparées et indépendamment mesurées.
Les données des courbes d'étalonnage ont été analysées en utilisant la méthode de régression des moindres carrés et évaluées par le coefficient de détermination (R2). Précision: L'évaluation de la variabilité intra-jour a été déterminée par 6 analyses
répliquées (n=6) sur des échantillons de plasma enrichis de chaque métabolite (ABZSO, ABZSO2) à une concentration de 0,1 µg/ml fraîchement préparées et analysées au cours du même jour.
Par contre la variabilité inter-jour (fidélité intermédiaire) a été déterminée par 6 analyses répliquées (n = 18) sur 3 jours consécutifs de la même concentration (0,1 µg/ml). La précision a été exprimée par le coefficient de variation (CV%) pour chaque concentration répliquée.
Exactitude: L’exactitude de la méthode analytique a été calculé par l’analyse répétée d'échantillons de plasma à blanc fortifiés à trois niveaux de concentrations différentes
(0,05-0,1-0,5µg/ml) de chaque métabolite (ABZSO et ABZSO2) sur 3 jours
consécutifs (n ≥ 3x3).
Les limites de détection et de quantification: La connaissance des seuils de quantification et de détection (LOD et LOQ) est nécessaire afin d’évaluer les performances de la méthode analytique et de vérifier sa capacité à quantifier les métabolites d’albendazole présents en faible concentration dans le plasma.
Les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ont été estimées en utilisant les équations (1) et (2), respectivement.
LOD = 3.3 σ/S (1) ; LOQ = 10 σ/S (2)
Où σ est l'écart type des résiduel de la droite de régression, S est la pente de la courbe d'étalonnage.
3. Protocole de l’étude pharmacocinétique comparative entre Albendazole (ABZ) et de son dérivé de synthèse (ABZBoc) :
3.1 Réactifs :
L’albendazole a été obtenu chez Mercure Pharmaceutical Ltd, Mumbai (Inde), le dérivé
(ABZBoc) a été synthétisé dans notre laboratoire. Le mèbendazole (MBZ) utilisé comme
standard interne a été fourni par Toronto Research Chemicals (Toronto,Canada).
3.2 Animaux :
Pour cette étude, nous avons utilisé 10 chiens mâles sains, pesant entre 14 et 19 kg (16,6 kg ± 3,97) de la clinique vétérinaire de l’IAV Hassan II de Rabat. Pendant l'essai, les animaux ont été maintenus dans des cages individuelles, et afin d’éviter l’influence de l’alimentation sur l’essai, ces chiens ont été privés d’alimentation 12 heures avant l’administration orale des deux formes de traitement (ABZ et ABZBoc). L’administration orale d’ABZ et d’ABZBoc a été réalisée au cours d’un repas par mélange de ces derniers avec de la viande hachée. Les chiens ont été répartis par randomisation en 2 groupes de 5.
1. Le premier groupe de chiens reçoit de l’albendazole à une dose unique de 10 mg/kg (Groupe A), par voie orale ;
2. Le second groupe de chiens reçoit le dérivé ABZBoc à la même dose et par la même voie que l’albendazole (Groupe B).
Les animaux ont été traités en conformité avec les directives de la Communauté européenne concernant les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale.
3.3 Collecte des échantillons :
A différents temps (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 16 et 24 h après le traitement), des échantillons de sang ont été collectés et mis dans des tubes héparinés.
Pour la séparation du plasma, une centrifugation est effectuée pendant 15 min à 3000 tr/min et conservés à -20 ºC jusqu'à l'analyse par HPLC.
Pour le dosage des taux plasmatiques des principaux métabolites (ABZSO et ABSO2), les échantillons de plasma ont été décongelés à température ambiante, puis une extraction a été réalisée selon la méthode précédemment décrite dans la première section de ce chapitre.
3.4 Analyse pharmacocinétique :
Les paramètres pharmacocinétiques ont été estimés sur la base des courbes de concentration plasmatique obtenues pour chaque métabolite (ABZSO et ABZSO2) après traitement avec l'albendazole et le dérivé ester ABZBoc, par une analyse non compartimentale, réalisée à l’aide du logiciel GraphPad (Prism 5 Demo).
La concentration plasmatique maximale (Cmax) et le temps pour atteindre la concentration maximale (Tmax) ont été lus à partir des courbes de concentration de chaque métabolite et pour chaque chien.
La surface sous la courbe, entre t0 et le temps de la dernière concentration quantifiable de 24h
(AUC0-24h) a été calculée par la méthode de trapèze linéaire [133], selon la formule suivante :
AUC0-24h
=
C24h/
keC24h étant la dernière concentration détectée après 24h d’administration et le ke représente la
constante d’élimination des métabolites, AUC0-24h calculée a été extrapolée à l'infini pour la détermination de (AUC0-∞). Ainsi la demi-vie d'élimination (t1/2) a été calculée comme :
t
1/2=
3.5 Analyse statistique :
L'analyse statistique des données a été effectuée à l’aide du logiciel SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, IBM13 for Windows). Les paramètres pharmacocinétiques ont été exprimés en moyenne ± SD (écart-type).
Le test t de Student a été utilisé pour la comparaison statistique des variables pharmacocinétiques en intergroupes, obtenues à partir des deux groupes de chiens. Les résultats ont été considérés comme étant statistiquement significatifs à la valeur de p <0,05.
Par contre la comparaison des moyennes des concentrations en intragroupe a été réalisée à l’aide du test two-way ANOVA, (***p<0.005 est considéré comme différence très significative, **p< 0,05 est considéré comme différence significative).
III. Résultats :
1. Résultats de la validation de la méthode de dosage des métabolites de