Protocole clinique

7.1. La biopsie musculaire à la pince chez l’Homme Description et usage

Historiquement, la technique de biopsie musculaire à l'aiguille a été décrite en 1868 par Duchenne. Cette technique a été reprise et développée dans la communauté scientifique scandinave chez le sujet sain. La biopsie est réalisée à l'aide d'un trocard mis au point en 1962 par Bergström. Les prélèvements musculaires sont pratiqués principalement au niveau de 4 muscles : vaste externe, deltoïde, soléaire et gastrocnémien. Le trocard utilisé par Bergström a été remplacé par la pince de Weil Blakesley en référence à l'étude de Henriksson (Henriksson, 1979), ce qui permet de prélever un fragment moyen de 100 mg de tissu musculaire. Une anesthésie locale de la peau et de l'aponévrose est réalisée quelques minutes avant la biopsie. Les analyses faites au laboratoire sur ce fragment tissulaire sont citées ci-après.

Pratique de cette technique dans le monde

Un bilan a été présenté par Bergström (Bergström, 1975) portant sur 5000 biopsies pratiquées dans de multiples circonstances de repos et d'exercices. Il est possible de réaliser ces biopsies avant ou dès l'arrêt d'exercices de toute nature. Sur l'ensemble des 5000 biopsies, Bergström rapporte un seul incident de lésion artérielle nécessitant une intervention chirurgicale et quelques hématomes intramusculaires qui se sont résorbés spontanément. Une large revue des résultats obtenus à partir de ces biopsies a été présentée par Saltin et al. (1977 et 1983). Elle montre à cette dernière date (1983) une utilisation courante de cette technique dans la communauté scientifique anglo-saxonne et scandinave.

Une biopsie à la pince est réalisée sous anesthésie locale conformément aux études récentes (Maltais et al., 1996 ; Bussieres et al., 1997 ; Lampert et al., 1998 ; Pouw et al., 1998). Les sujets ne doivent pas avoir fait d’efforts significatifs dans les 24 heures précédentes. La biopsie musculaire sera réalisée dans le muscle vaste externe :

- Localisation : face antéro-externe de la cuisse, jonction 1/3 inférieur - 1/3 moyen du segment joignant l'interligne fémoro-tibial et l'épine iliaque antéro-supérieure ;

- Rasage large et dégraissage (éther) nettoyage (alcool et Bétadine) ;

- Anesthésie locale (Xylocaïne 2%) de la peau et de l'aponévrose musculaire ;

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- Incision cutanée et aponévrotique sur une longueur de 6 à 10 mm ;

- Introduction d'une pince de Weil-Blakesley de petite taille (3,5 mm de diamètre) à une profondeur de 1 cm dans le muscle ;

- Ouverture de la pince, section et extraction du tissu ;

- Compression au poing d'une durée de 5 minutes dès l'extirpation de la pince ; - Fermeture par bandes adhésives maintenues en place pendant 5 jours ;

La quantité moyenne de tissu obtenu par cette technique est de 100 mg. Cette biopsie est répartie en 3 fragments sur une plaque stérile dépourvue d’ARNases :

• 20 mg pour l’analyse ultra structurale, immédiatement congelé dans l’azote liquide via son immersion 10 secondes dans un récipient rempli d’isopentane, lui même plongé dans l’azote liquide. Le fragment est ensuite placé dans un tube Eppendorf pour analyse ultérieure.

• 40 mg pour l’étude de l’expression des gènes par le micro array spécifique du muscle squelettique. Ce fragment est préservé dans un milieu ARNase free. Une extraction secondaire de l’ARN est faite puis cet ARN est réparti sur le micro-array.

• 40 mg pour l’analyse oxygraphique. Une fois prélevés, les fragments musculaires sont conservés dans une solution A dite solution de conservation, contenant en particulier: ATP + PCr à 4°C. Les fibres sont ensuite dilacérées à l’aide de pinces chirurgicales sous une loupe binoculaire, afin de permettre une meilleure action du détergent. Puis, elles sont placées dans la solution A contenant de la saponine à une concentration de 50 µ g/mL.

Cette étape de perméabilisation se déroule à 4°C, pendant 30 min. et sous une agitation constante et modérée. Les fibres ainsi perméabilisées sont lavées deux fois 10 minutes dans une solution B ou solution de respiration, sans composés phosphorylés toujours à 4°C et sous agitation. Ces lavages permettent l’élimination de la saponine, de la phosphocréatine et des nucléotides adényliques contenus dans la solution de conservation.

Ce détergent se combine au cholestérol rendant les sarcolemmes perméables à l’ADP.

L’ajout de ce dernier au cours des expériences réalisées permet de déterminer les variables cinétiques (Vmax = vitesse maximale de consommation d'oxygène et Km apparent pour l'ADP) sur les tracés obtenus par l’oxygraphe. Cette technique possède de nombreux avantages, elle est économique et simple à réaliser. En effet, elle permet de conserver le milieu intracellulaire et donc de faire une étude de la fonction mitochondriale «in situ».

Elle évite également d’endommager les membranes des mitochondries (quasiment

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dépourvues de cholestérol). On obtient ainsi une préparation de fibres composée de mitochondries intactes. A partir des fibres perméabilisées, on réalisera les tests suivants : test au cytochrome C dans le but d’étudier l’intégrité de la membrane externe mitochondriale, test à la créatinine pour éliminer une lésion ischémique, une cinétique de la respiration mitochondriale avec l’ADP. A partir de cette cinétique, on détermine la V₀ ou consommation d’oxygène (nmol O2/min/mg tissu sec) sans ADP, Vmax en présence d’ADP et le Km pour l’ADP. Enfin, en fonction des données acquises, en utilisant des substrats et des inhibiteurs spécifiques, on pourra aisément déterminer les activités des différents segments de la chaîne respiratoire mitochondriale.

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7.2. Evaluation des sujets

L’évaluation initiale et finale est réalisée après signature du consentement éclairé et est faite à J0 et J90 en Hôpital de Jour du Département de Médecine Aiguë Spécialisée au 4èmeD ou au Centre d’Investigations Cliniques (CIC, INSERM) pour les témoins et les transplantés pulmonaires. Ces évaluations s’intègrent au programme de surveillance réglée de ces patients évitant ainsi tout déplacement supplémentaire pour cette étude.

Ces explorations sont réalisées deux fois chez les témoins. Sont relevés les données anthropométriques : âge, sexe, poids, taille et composition corporelle par impédancimétrie [83]. ECG, VEMS, CV sont enregistrés. Un questionnaire de qualité de vie SF36 est administré. Une épreuve d’effort maximale est réalisée après un échauffement de 5 minutes, par paliers de 20 watts et de 1 minute jusqu’à la capacité maximale de chaque individu. Une lactatémie est prélevée à la fin de l’exercice. Une épreuve d’endurance est réalisée à 80% de la puissance maximale atteinte lors du premier test.

Une mesure de la force du quadriceps est réalisée avant et après l’épreuve d’endurance. De façon à rendre cette mesure peu coopérante et éviter la variabilité liée aux difficultés d’obtention d’une contraction maximale reproductible (coopération dépendante, recrutement variable d’agonistes et antagonistes selon les sujets apportant une contribution non quantifiable à la force mesurée), une mesure de force maximale en réponse à une stimulation magnétique du quadriceps sera réalisée. Cette méthode réalise une stimulation supra maximale unique du nerf fémoral et induit une contraction brève (secousse musculaire unique, (‘twitch’ tension) du muscle quadriceps). Cette méthode a l’intérêt de ne stimuler que les fibres efférentes du nerf et constitue une méthode indolore (à la différence, par exemple, de la stimulation électrique du nerf utilisée en électrophysiologie classique qui active également des fibres sensitives). Le champ magnétique induit ne contre-indique pas l’utilisation en cas d’implants métalliques (clous, vis, plaques) mais, en raison de sensations et stimulations sensitivo-sensorielles modifiables, cet usage ne sera pas réalisé en cas d’implants métalliques (prothèse de hanches). En pratique, le sujet est assis en position neutre, genou à 90°.

L’activation préalable du nerf fémoral (facilitation) est évitée en soutenant le talon du sujet en position neutre à 90°. Cette méthode est appliquée à deux reprises au repos puis après test d’effort en endurance selon procédures ci dessus.

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