Propriétés des gels protéiques induits par réaction enzymatique

L’extraction de la fraction protéique de pois totale (PPT) a été réalisée dans des conditions alcalines en présence de sel (0.1 M Na3HPO4, pH 8 et 1% K2SO4) comme décrit précédemment dans le chapitre IV (§ II.2.1). L’extrait protéique PPT est composé d’environ 20% albumines et 80% globulines.

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II.2.1.2. Capacité de rétention d’eau

La capacité de rétention d’eau (CRE) des gels réticulés par MTGase a été déterminée par centrifugation (Kuhn et al., 2011). Environ 2 g de solution protéique à la concentration désirée ont été introduits dans des tubes hermétiques puis incubés pendant 10 h à 40° C, pH7 en présence de 20 unités MTGase/g protéine. Après 24 h, les gels formés ont été centrifugés (1500 x g, 5 min, 20 °C) et l’eau libérée a été pesée. La CRE a été calculée par l’équation (V.1) :

CRE = 100 * [1- (Eau_libérée/ Eau_gel)] ………..(V.1)

où:

Eaulibérée est la masse en g de l’eau libérée après centrifugation ;

Eaugel est la masse en g de l’eau contenue dans le gel avant centrifugation.

II.2.1.3. Rhéologie des gels

L’évolution des propriétés rhéologiques des solutions de PPT (15% m/m) en cours de traitement enzymatique (20 unités MTGase/g protéine, pH 7) a été réalisée dans le but d’étudier l’effet de la température d’incubation sur la cinétique de gélification. Le protocole est décrit dans le chapitre IV (§ II.2.5).

II.2.2. Préparation et caractérisation des microparticules II.2.2.1. Préparation

Les microparticules de protéines de pois ont été préparées par une émulsion eau dans huile (E/H) suivie d’une gélification par voie enzymatique (Heidebach et al., 2009). Une dispersion protéique à 15% (m/m) a été préparée dans un tampon phosphate (50 mM, pH 7). Après 2 h d’agitation, l’enzyme a été ajoutée à la solution protéique à raison de 20 unités MTGase/g protéine et l’ensemble (20g) a été rapidement introduit sous agitation (barreau magnétique ~ 900 rpm) dans des flacons contiennant 100 g d’huile (Miglyol® 812 N) préalablement chauffée à 45 °C en présence ou en absence d’émulsifiant (PGPR). Après 2 h d’incubation, sous l’action de la MTGase, les globules de PPT dispersées ont été gélifiés et transformés en microparticules. Les microparticules ont été séparées de l’huile par une centrifugation douce (1000 x g, 5 min), lavées deux fois avec de l’eau en présence de 2% de tween 80, puis récupérées sur un papier filtre et lyophilisées. Dans certain cas, dans le but de

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réduire la taille des microparticules, un Ultra-Turrax (IKA T25) a été utilisé au début du process d’agitation (5 min, 10000 rpm).

II.2.2.2. Distribution de taille des microparticules

La distribution de taille des microparticules obtenues a été réalisée par un granulomètre laser Mastersizer 2000 (Malvern Instruments, Southborough, MA). Toutes les mesures ont été réalisées avec un angle de diffusion de 90° à 25 °C.

II.2.2.3. Morphologie des microparticules

La morphologie et la structure externe des microparticules ont été visualisées par un microscope optique (Nikon TE2000) équipé d’une caméra (EMCCO Andor iXon +885).

II.2.2.4. Solubilité des microparticules

La solubilité des microparticules a été réalisée dans des milieux gastriques synthétiques (solution HCl à pH 1.2) en présence et en absence de 0.1% de pepsine, et intestinal (tampon phosphate à pH 7.4) en présence et en absence de 1 % de pancréatine

(Chen et Subirade, 2009). Deux cent mg de microparticules lyophilisées ont été dispersés dans les quatre milieux digestifs (30 ml) sous une agitation continue (~ 100 rpm) à 37 °C. Deux ml de surnageant n’incluant pas de particule ont été prélevés à des intervalles de temps réguliers et la quantité de protéine a été dosée par Kjeldahl. Pour chaque milieu étudié, un volume de milieu digestif équivalent à celui prélevé a été rajouté pour maintenir un volume constant. Le pourcentage de protéines solubles pour chaque point a été calculé à partir de l’équation (V.2).

% protéines soluble = (QPi/QPT) *100………..(V.2)

QPi : quantité des protéines dissoutes (cumulée) à l’ instant i ;

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II.2.3. Encapsulation de la riboflavine II.2.3.1. Procédé d’encapsulation :

Le procédé d’encapsulation de la riboflavine a été réalisé comme décrit précédemment pour l’élaboration des microparticules. La riboflavine a été introduite dans la solution protéique avant l’ajout de la MTGase.

II.2.3.2. Capacité et rendement d’encapsulation

Deux cent mg de microparticules encapsulant la riboflavine ont été dissoutes dans 25 ml d’un milieu intestinal (pH 7.4) en présence de 1% de pancréatine à 37°C sous une forte agitation pendant 6 h (Chen et Subirade, 2009). Le mélange a été centrifugé et la riboflavine a été dosée dans le surnageant par un spectrophotomètre UV (Spectronic BioMate 3) à une longueur d’onde de 445 nm en se référant à une courbe d’étalonnage. Le rendement (RE) ainsi que la capacité d’encapsulation (CE) ont été calculées par les équations (V.3 et V.4) :

RE = A/B * 100………..(V.3) CE = A/C * 100……….………..(V.4)

A : la quantité de riboflavine encapsulée dans la prise d’essai ;

B : la quantité de riboflavine introduite initialement pour l'encapsulation correspondante à la prise d’essai (théorique) ;

C : la masse de la prise d’essai (microparticules).

II.2.3.3. Cinétique de libération dans un milieu gastrique et intestinal

La cinétique de libération de la riboflavine a été étudiée dans les milieux gastrique et intestinal en présence et en absence des enzymes digestives. 200 mg de microparticules lyophilisées ont été suspendues dans 30 ml de chacun des milieux digestifs sous une faible agitation (100 rpm) à 37 °C. Deux millilitres de surnageant n’incluant pas de particule ont été prélevés à des intervalles de temps réguliers puis centrifugés (12000 x g, 10 min) et la quantité de riboflavine dans le surnageant a été dosée à 445 nm. Pour chaque milieu étudié, un volume de milieu équivalent à celui prélevé a été rajouté pour maintenir les mêmes conditions. Le pourcentage de riboflavine libérée pour chaque point a été calculé à partir de l’équation (V.5).

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% riboflavine libérée = (QRi/QRT) *100………..(V.5)

QRi : quantité de la riboflavine libérée à l’instant i ;

Q_RT : quantité de la riboflavine totale encapsulée dans la prise d’essai. Elle est calculée après dissolution totale des microparticules (6h).

II.2.4. Analyse statistique

Tous les essais ont été répétés au minimum trois fois. L'analyse de variance (ANOVA) des résultats a été réalisée par le logiciel XLSTAT Pro version 2013. Le test Fisher’s a été appliqué avec un intervalle de confiance de 95%.

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III. Résultats et discussion

Rappelons qu’une des finalités de l’étude est d’élaborer des microparticules pour encapsuler des molécules actives afin de les protéger et contrôler leur libération dans le tractus gastro-intestinal. Les microparticules doivent être suffisamment fortes pour résister aux stress mécaniques pendant le process d’encapsulation jusqu’à la conservation ; elles doivent avoir une bonne capacité de rétention d’eau ainsi qu’une dégradation lente dans les milieux digestifs pour contrôler la libération des molécules encapsulées.