Méthodes spectrophotométriques: OPA et TNBS

A l’origine, les méthodes spectrophotométriques utilisant les réactifs, acide O-phtaldiadehyde (OPA) et l’acide trinitrobenzène sulfonique (TNBS), ont été utilisées pour

200 55 36 29 24 66 97 116 45 20 V(35) V(33) V(55) Lα(40) V(30) Lβ(20) CV(71) M T 10 30 60 120 300 min V(50)

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suivre le degré d’hydrolyse des protéines (Silvestre, 1997). Le principe repose sur le suivi de l’évolution des groupements amines qui se libèrent au cours de la réaction d’hydrolyse. Par analogie, la méthode a été adoptée pour la réticulation enzymatique en suivant les groupements amine libres en cours de réaction, déduisant ainsi ceux qui disparaissent suite à leur implication dans la réaction enzymatique (Dinnella et al., 2002 ; Gan et al., 2009). Ainsi, le degré de réticulation peut être calculé à partir du rapport de la quantité d’amine libre après et avant réaction enzymatique.

La cinétique de la réticulation enzymatique de la fraction Glob (1% m/m), traitée avec 10 unités MTGase/g protéine à pH 7 et 40 °C, a été étudiée par les méthodes spectrophotométriques à l’OPA et au TNBS. Les résultats sont présentés respectivement dans les Figures III.2 et III.3.

Figure III.2. Evolution de l’absorbance des groupements amines libres analysés par la méthode OPA de la fraction Glob (1% m/m) en cours de traitement enzymatique (10 unités MTGase/g de protéine à 40 °C et pH 7). Atot : absorbance de la fraction Glob traitée ; Asn : absorbance du surnageant après une précipitation acide ; Acorr : absorbance corrigée (Atot-Asn).

Les valeurs d’absorbance des amines libres de la fraction Glob traitée avec la MTGase (Atot), des deux méthodes OPA et TNBS, sont constantes tout le long du traitement, donnant l’impression que la réaction enzymatique n’a pas eu lieu. Or, l’électrophorèse a bien montré le contraire (Figure III.1). Ceci est dû aux interférences de l’ammoniaque libéré en parallèle de

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la formation du fragment Gln-Lys. En effet, la réaction enzymatique est stœchiométrique, les amines libres des résidus lysine consommées sont remplacées par l’ammoniaque qui forme, avec les réactifs OPA et TNBS des complexes qui absorbent à 340 nm, remontant l’absorbance à sa valeur initiale. Une correction d’absorbance est donc nécessaire pour pouvoir quantifier le degré de réticulation. Pour se faire, l’ammoniaque est dosé dans le surnageant (Asn) après une précipitation acide des protéines. Les amines des protéines non-consommées (libres) par la réaction enzymatique sont déduites par soustraction de l’absorbance totale (Acorr = Atot - Asn) (Dinnella et al, 2002).

Figure III.3. Evolution de l’absorbance des groupements amines libres analysés par la méthode TNBS de la fraction Glob (1% m/m) en cours de traitement enzymatique (10 unités MTGase/g de protéine à 40 °C et pH 7). Atot : absorbance de la fraction Glob traitée ; Asn : absorbance du surnageant après une précipitation acide ; Acorr : absorbance corrigée (Atot-Asn).

Une augmentation de l’absorbance en fonction de la durée de traitement enzymatique du surnageant (Asn) est constatée. Ceci est dû à l’ammoniaque libéré mettant en évidence la réaction enzymatique.

Une diminution de groupements amines libres (Acorr) est constatée en fonction de la durée de traitement rendant compte de la quantité du fragment Gln-Lys formé. Au début de la réaction, l’absorbance corrigée diminue rapidement et se stabilise après 2 heures. Cela

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s’explique par la disponibilité et l’accessibilité des groupements NH2 libres au début de la réaction et de leur disparition progressive en fonction du temps.

Les rendements de réticulation de la fraction Glob (1% m/m) en fonction de la durée d’incubation déterminés par les méthodes OPA et TNBS sont présentés dans la Figure III.4.

Les degrés de réticulation augmentent rapidement avec la durée d’incubation durant les deux premières heures. Ils atteignent une valeur de 25% après deux heures de traitement et ne dépassent pas les 26 % après 5 heures.

Figure III.4. Rendement de réticulation de la fraction Glob (1% m/m) déterminés par les méthodes OPA et TNBS en fonction de la durée d’incubation.

La Figure III.5 compare les rendements de réticulation déterminés par les deux méthodes (OPA et TNBS). Un coefficient de corrélation de 0.992 est obtenu, indiquant que les résultats sont très proches. La méthode à l’OPA est cependant relatée comme étant plus facile à mettre en œuvre, plus rapide, plus sensible et plus sûre d’un point de vue environnemental par rapport à la méthode TNBS (Silvestre, 1997).

La méthode à l'OPA a été utilisé par Dinnella et al., (2002) pour l'étude de la cinétique de réticulation de la caséine. Ces auteurs ont conclu que la méthode OPA est bien adaptée pour le suivi de la réticulation enzymatique. Ceci a été contredit par Flanagan et al. (2003), qui ont suggéré que les groupes amines libres du caséinate de sodium, après traitement enzymatique, sont emprisonnés à l’intérieur du réseau réticulé formé (gel), les rendant

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inaccessibles au réactif OPA et conduisant à une sous-estimation de groupes amines libres et donc à une surestimation du degré de réticulation. Les deux résultats nous semblent corrects et la seule différence se résume dans la concentration du substrat utilisée. En effet, dans la première étude (Dinnella et al., 2002) une concentration de 0.24 % (m/v) a été utilisée soit 16 fois moins que dans la seconde étude où une concentration de 4 % (m/v) est utilisée (Flanagan et al., 2003). Dans le premier cas la concentration en protéine est très faible et aucun réseau tridimensionnel continu n’est formé, maintenant ainsi les groupes amines libres toujours accessibles à l’OPA. Par contre, avec une concentration de 4%, un réseau tridimensionnel formant un gel est constitué rendant les amines libres inaccessibles au réactif OPA. Donc, la Méthode OPA est à utiliser avec précaution.

Figure III.5. Corrélation entre les rendements de réticulation déterminés par les méthodes OPA et TNBS.