2 Matériel et méthodes
3.2 Propriété cytoprotectrice de polyphenols vis-à-vis les effets toxiques de la nicotine
Dans la deuxième partie de cette étude, la capacité de polyphenols dérivés de plantes ou de petits fruits, à neutraliser les effets cytotoxiques de la nicotine a été évaluée. Un criblage des polyphenols (purs ou présents dans un extrait brut) sélectionnés pour l'étude a d'abord été effectué chez les cellules épithéliales afin de vérifier leur potentiel cytoprotecteur vis-à- vis les effets toxiques induits par la nicotine. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide du test colorimétrique MTT, qui détermine la respiration mitochondriale. Cette analyse a permis d'identifier l'extrait brut de cassis de même que trois anthocyanines (cyanidine-3- glucoside, cyanidine-3-rutinoside, delphinidine-3-rutinoside) et un catéchine (EGCG) comme potentiellement intéressants (tableau 3). Ces polyphenols ont été utilisés pour la continuité du projet. Les résultats obtenus ont démontré qu'un pré-traitement avec un extrait brut de cassis (> 5 pg/ml) entraîne une neutralisation de manière dose-dépendante des effets cytotoxiques induits par la nicotine (> 50 pg/ml) chez les cellules épithéliales et (> 25 pg/ml) chez les fibroblastes gingivaux (figures 10a et 10b). Plus précisément, à une concentration finale de 100 pg/ml de nicotine, une perte de viabilité significative (p < 0.005) de 55 ± 2% a été observée dans le cas des cellules épithéliales. Le pré-traitement avec l'extrait brut de cassis à une concentration finale de 5 pg/ml n'a entraîné aucune cytoprotection significative (p < 0.005) des cellules épithéliales. Toutefois, à des concentrations finales de 25 pg/ml et 50 pg/ml, l'extrait a permis de réduire significativement (p < 0.005) la perte de viabilité des cellules épithéliales de 29 ± 3% et de 43 ± 5% (figure 10a). D'autre part, à une concentration finale de 75 pg/ml de nicotine, une perte de viabilité significative (p < 0.005) de 74 ± 1% a été observée dans le cas des fibroblastes. Le pré-traitement avec l'extrait brut de cassis à une concentration finale de 5 pg/ml n'a entraîné aucune cytoprotection significative (p < 0.005) des fibroblastes. Cependant, à des concentrations finales de 25 et 50 pg/ml, l'extrait brut de cassis a entraîné une cytoprotection significative (p < 0.005) de 31 ± 2% et de 48 ± 2% des fibroblastes (figure 10b).
Les trois anthocyanines majeures contenus dans l'extrait brut de cassis ont ensuite été évaluées pour leur propriété de cytoprotection. Les résultats ont montré que la cyanidine-3- glucoside (figures lia et 11b), la cyanidine-3-rutinoside (figures 12a et 12b) et la delphinidine-3-rutinoside (figures 13a et 13b) pouvaient entraîner une cytoprotection tout autant chez les cellules épithéliales que chez les fibroblastes exposés à la nicotine. Parmi celles-ci, à une concentration finale de 25 pg/ml, la cyanidine-3-glucoside s'est avérée la plus efficace pour entraîner une neutralisation des effets cytotoxiques induits par la nicotine chez les cellules épithéliales et les fibroblastes gingivaux (figures lia et 11b). À une concentration finale de 100 pg/ml de nicotine, une perte de viabilité significative (p < 0.005) de 57 ± 2% a été observée dans le cas des cellules épithéliales (figure 1 la). Le pré- traitement avec la cyanidine-3-glucoside à une concentration finale de 25 pg/ml a entraîné une cytoprotection des cellules épithéliales significative (p < 0.005) de 38 ± 5% (figure lia). D'autre part, à une concentration finale de 75 pg/ml de nicotine, une perte de viabilité significative (p < 0.005) de 62 ± 2% a été observée dans le cas des fibroblastes (figure 1 lb). Le pré-traitement avec la cyanidine-3-glucoside à une concentration finale de 25 pg/ml a entraîné une cytoprotection significative (p < 0.005) de 41 ± 6% des fibroblastes (figure 1 lb). Le résultat obtenu en utilisant la cyanidine-3-glucoside à une concentration finale de 25 pg/ml et la nicotine à une concentration finale de 50 pg/ml a révélé qu'en plus de la cytoprotection, la cyanidine-3-glucoside semble favoriser la prolifération des fibroblastes (figure 11b). De tels effets d'une augmentation de la prolifération cellulaire des fibroblastes ont également été observés sous certaines conditions avec les deux autres anthocyanines (figures 12b et 13b).
L'EGCG, le polyphenol majeur du thé vert, a également démontré une propriété cytoprotectrice vis-à-vis les cellules épithéliales et les fibroblastes. Plus spécifiquement, un pré-traitement à l'EGCG s'est avéré capable de neutraliser les effets cytotoxiques induits par la nicotine chez les cellules épithéliales (nicotine à des concentrations finales de 50 et 75 pg/ml) et les fibroblastes (nicotine à des concentrations finales de 25 et 50 pg/ml) de manière dose-dépendante (figures 14a et 14b).
Tableau 3 : Résultats du criblage d'une variété de polyphenols en regard de leur propriété de cytoprotection vis-à-vis les effets toxiques de la nicotine sur les cellules épithéliales.
Polyphenols Concentration Potentiel
maximale testée* cytoprotecteur (pg/ml)
Extraits bruts NDM (canneberge) 100 Non
PACs de type A (canneberge) 100 Non
CT1 (canneberge) 100 Non
CT2 (canneberge) 100 Non
Pépins de raisins rouges 100 Non
Réglisse 25 Non
Cassis 100 Oui
Purs Cyanidine-3-glucoside 100 Oui
Cyanidine-3-rutinoside 100 Oui Delphinidine-3-rutinoside 100 Oui EGCG 25 Oui Licoricidine 1 Non Licorisolflavan A 1 Non Myricétine 25 Non Quercétine 25 Non
* Les polyphenols ont été utilisés à la plus forte concentration ne toxicité envers les cellules épithéliales.
140 Cassis (pg''ml) Nicotine (pg/ml) 5 25 50 - 3 25 50 100100100100 - 5 25 50 - 5 25 50 50 50 50 50 75 75 75 75 Conditions
Figure 10a : Effets du pré-traitement avec un extrait brut de cassis sur la viabilité des cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*:p< 0.005 vs contrôle sans nicotine, f: p < 0.005 contrôle sans extrait brut de cassis).
120 Cassis Oigml) Nicotine (pg/ml) 5 25 50 - 5 25 50 75 75 75 75 • 5 25 50 - 5 25 50 25 25 25 25 50 50 50 50 Conditions
Figure 10b : Effets du pré-traitement avec un extrait brut de cassis sur la viabilité des fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*:p< 0.005 vs contrôle sans nicotine, f : p < 0.005 contrôle sans extrait brut de cassis).
120
C30(pg/ml) 5 25 - 5 25 5 25 - 5 25
Nicotine (pg/uiD - - 50 50 50 75
Conditions
75 75 100 100 100
Figure 11a : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-glucoside (C3G) sur la viabilité des cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*: p < 0.005 vs contrôle sans nicotine, f : p < 0.005 contrôle sans cyanidine-3-glucoside).
140 C3G (pg/ml) Nicotine (pg/nil) 5 25 - 5 25 - 5 25 25 25 25 50 50 50 Conditions 5 25 75 75 75
Figure 1 lb : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-glucoside (C3G) sur la viabilité des fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*: p < 0.005 vs contrôle sans nicotine, f: p < 0.005 contrôle sans cyanidine-3-glucoside).
120- C3R(pg/uil) Nicotine (pg/nil) 3 25 - 5 25 - 5 25 50 50 50 75 75 75 Conditions - 5 25 100100100
Figure 12a : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-rutinoside (C3R) sur la viabilité des cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*: p < 0.005 vs contrôle sans nicotine, f: p < 0.005 contrôle sans cyanidine-3-rutinoside).
140-1 C3R(ug/inl) Nicotine (pg/ml) 5 25 - 5 25 • 5 25 25 25 25 50 50 50 Conditions - 5 25 75 75 75
Figure 12b : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-rutinoside (C3R) sur la viabilité des fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*: p < 0.005 vs contrôle sans nicotine, f : p < 0.005 contrôle sans cyanidine-3-rutinoside).
140 D3R0ig/ml) Nicotine (pg/ml) - 5 25 100100100 Conditions
Figure 13a : Effets du pré-traitement avec la delphinidine-3-rutinoside (D3R) sur la viabilité des cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*: p < 0.005 vs contrôle sans nicotine, "f: P 5 0.005 contrôle sans delphinidine-3-rutinoside).
140 D3R (pg/ml) Nicotine (pg/ml) - 5 25 - 5 25 25 25 25 50 50 50 Conditions • 5 25 75 75 75
Figure 13b : Effets du pré-traitement avec la delphinidine-3-rutinoside (D3R) sur la viabilité des fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*: p < 0.005 vs contrôle sans nicotine, f: p < 0.005 contrôle sans delphinidine-3-rutinoside).
1
120 100 80 60 40 20 EOCOOig/uil) - 1 5 - 1 5 Nicotine (pg/ml) - 50 50 50 ConditionsFigure 14a : Effets du pré-traitement avec l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) sur la viabilité des cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisés avec le test t de Student (*:p< 0.005 vs contrôle sans nicotine, f : p < 0.005 contrôle sans EGCG).
I
VI
140 120 100 EGCG (pg/ml) - 1 5 1 5 - 1 5 Nicotine (pg nil) • - - 25 25 25 Conditions 50 50 50Figure 14b : Effets du pré-traitement avec l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) sur la viabilité des fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine. Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en quadruple pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*: p < 0.005 vs contrôle sans nicotine, f : p < 0.005 contrôle sans EGCG).