Propriété anti-inflammatoire de polyphenols vis-à-vis les cellules épithéliales exposées à la nicotine

La dernière partie de cette étude consistait à vérifier la capacité des polyphenols qui ont démontré une propriété de cytoprotection à réduire la sécrétion de cytokines par les cellules épithéliales exposées à la nicotine. La nicotine à une concentration finale de 50 pg/ml a induit la sécrétion de la chimiokine CCL5 par les cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K alors qu'elle n'a eu aucun effet sur la sécrétion de 1TL-6 et de 1TL-8 (données non-montrées). De plus, la nicotine n'a eu aucun effet sur la sécrétion de 1TL-6, de 1TL-8 et de la CCL5 par les fibroblastes (données non-montrées). Un pré-traitement avec l'extrait brut de cassis s'est avéré capable de réduire la sécrétion de CCL5 par les cellules épithéliales (figure 15). Plus précisément, le taux de CCL5 sécrété suite à la stimulation par la nicotine (50 pg/ml) était de 617 ± 15 pg/ml comparativement à 516 ± 15 pg/ml obtenus pour le contrôle des cellules non stimulées. Un pré-traitement à l'extrait brut de cassis à une concentration finale de 25 pg/ml a réduit de façon significative (p < 0.005) le taux de CCL5 sécrété de 27%. L'effet de la cyanidine-3-glucoside contenue dans l'extrait brut de cassis a ensuite été évalué. Un pré-traitement avec cette anthocyanidine a également neutralisé les effets inflammatoires de la nicotine en diminuant la sécrétion de CCL5 par les cellules épithéliales (figure 16). Plus spécifiquement, la nicotine (50 pg/ml) a induit une sécrétion de CCL5 par les cellules épithéliales de 669 ± 16 pg/ml comparativement au contrôle qui était 436 ± 16 pg/ml. Un pré-traitement à la cyanidine-3- glucoside à un concentration finale de 25 pg/ml a réduit significativement (p < 0.005) le taux de CCL5 sécrété de 58%. Enfin, un pré-traitement à l'EGCG s'est également avéré efficace significativement (p < 0.005) pour réduire la sécrétion de CCL5 par les cellules épithéliales traitées à la nicotine (figure 17). Le taux de CCL5 sécrété suite à la stimulation par la nicotine (50 pg/ml) était de 593 ± 14 pg/ml comparativement à 411 ± 13 pg/ml obtenus pour le contrôle des cellules non stimulées. Un pré-traitement à l'EGCG à des concentrations finales de 5 et 10 pg/ml a réduit significativement (p < 0.005) le taux de CCL5 sécrété de 59% et de 88%, respectivement (figure 17).

700-, 600 500

S

Figure 15 : Effets du pré-traitement avec un extrait brut de cassis sur la sécrétion de CCL5 par les cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine (50 pg/ml). Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en triplicata pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student, (f: p < 0.005 contrôle sans extrait brut de cassis)

8OO-1 700 600 500 400 300 200 100 C3G0ig/ml) Nicotine + Conditions

Figure 16 : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-glucoside (C3G) sur la sécrétion de CCL5 par les cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine (50 pg/ml). Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en triplicata pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*: p < 0.005 vs contrôle sans nicotine, f: p < 0.005 contrôle sans cyanidine-3-glucoside).

! 70(h 600 50O 400 a-, O 3001 20O 100 EGCGOij/nil) Nicotine + Conditions 5 + 10 +

Figure 17 : Effets du pré-traitement avec l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) sur la sécrétion de CCL5 par les cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine (50 pg/ml). Les résultats sont exprimés selon les moyennes ± les déviations standards d'essais menés en triplicata pour un minimum de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le test t de Student (*: p < 0.005 vs contrôle sans nicotine, f: p < 0.005 contrôle sans EGCG).

3.4 Pouvoir antioxydant

Dans la dernière partie de cette étude, le pouvoir antioxydant des polyphenols à l'étude ayant démontré des propriétés cytoprotectrices et anti-inflammatoires contre les effets induits par la nicotine a été mesuré. L'indice TAC révèle l'activité antioxydante globale d'une substance. Plus cet indice est élevé, plus la fraction est antioxydante. L'extrait brut de cassis ainsi que la cyanidine-3-glucoside, la cyanidine-3-rutinoside, la delphinidine-3- rutinoside et l'EGCG ont démontré un indice TAC très élevé comparativement à un extrait brut de réglisse, une fraction utilisée comme contrôle et qui n'avait démontré aucune activité cytoprotectrice contre les effets toxiques de la nicotine (tableau 4).

Tableau 4 : Indice de la capacité antioxydante totale de divers polyphenols.

Polyphenols Concentrations Indice TAC

(pg/ml) (pM) (pM)

Extrait brut de cassis 2 - 279

Cyanidine-3 -glucoside 2 4.45 413

Cyanidine-3-rutinoside 2 3.36 438

Delphinidine-3-rutinoside 2 3.27 409

EGCG 2 4.36 421

4 Discussion

Les maladies parodontales sont des pathologies buccales caractérisées par une infection bactérienne et une réaction inflammatoire menant à la destruction des tissus de soutien des dents qui constituent le parodonte. Parmi les quelques 700 espèces bactériennes présentes dans la cavité buccale (Aas et al, 2005), quatre espèces à Gram négatif retrouvées dans le biofilm dentaire sous-gingival, soit A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. forsythia et T. denticola, ont été fortement associées au développement des différentes formes de parodontites (Haffajee et Socransky, 1994; Socransky et a l , 1998). Ces bactéries à potentiel pathogène possèdent de nombreux facteurs de virulence, tels des adhésines, du LPS et des enzymes hydrolytiques, qui leur permettent de coloniser l'espace sous-gingival, d'échapper au système de défense de l'hôte et de détruire les tissus parodontaux. Bien que les bactéries parodontopathogènes soient le facteur étiologique primaire des parodontites, la réponse immunitaire de l'hôte, en réaction à l'agression bactérienne constante, est le facteur déterminant dans la progression de la maladie. Un certain nombre de médiateurs de l'inflammation (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-a, PGE2) et de MMPs (MMP-2, MMP-3, MMP-8,

MMP-9) ont été associés à la progression et à la sévérité des parodontites (Houle et Grenier, 2003).

Plusieurs études ont clairement démontré le rôle de la fumée de cigarette en tant que facteur de risque significatif pour le développement et la progression des atteintes parodontales (Johnson et Slach, 2001; Jacob et al, 2007). Parmi les nombreuses substances contenues dans la fumée du tabac, la nicotine, appartenant à la famille des alcaloïdes, est l'agent pharmacologique actif responsable de la dépendance à la cigarette et de ses effets toxiques systémiques (Yildiz, 2004). Plus particulièrement, la nicotine est considérée être majoritairement responsable de l'impact négatif de la fumée de cigarette sur les atteintes parodontales puisqu'elle est en contact direct avec les cellules épithéliales et les fibroblastes de la cavité buccale et qu'elle s'accumule au niveau de la surface radiculaire

(Cuff et al, 1989). La concentration de la nicotine dans le liquide créviculaire des fumeurs s'élève à environ 300 fois celle retrouvée dans le sang (Ryder et al, 1998).

Dans cette étude, les effets toxiques de la nicotine, seule et en combinaison avec le LPS d'A. actinomycetemcomitans ou de P. gingivalis, vis-à-vis les cellules épithéliales et les fibroblastes d'origine buccale ont d'abord été déterminés. Les cellules mucosales buccales à l'étude ont été traitées avec la nicotine combinée ou non avec le LPS. La viabilité cellulaire a par la suite été mesurée à l'aide d'un test colorimétrique MTT. Il a été démontré que la nicotine (> 50 pg/ml) cause une perte significative (p < 0.005) de la viabilité cellulaire d'une manière dose-dépendante chez les cellules épithéliales et les fibroblastes d'origine buccale. Les cellules épithéliales sont les premières cellules de la cavité buccale à entrer en contact avec la nicotine contenue dans la fumée du tabac. Puisque ces cellules agissent en tant que barrières physiques pour protéger les autres cellules telles les fibroblastes et les ostéoblastes, les effets délétères de la nicotine pourraient contribuer aux dommages tissulaires. De plus, les effets toxiques sur les fibroblastes pourraient diminuer significativement les processus de réparation et de régénération des tissus parodontaux. Nos résultats sont en accord avec ce qui a déjà été rapporté dans la littérature. En effet, il a été démontré que la nicotine affecte les fonctions et la croissance des fibroblastes de la gencive et du ligament parodontal de l'humain d'une manière dose-dépendante (Tipton et Dabbous, 1995; Alpar et al, 1998; James et al, 1999; Chang et al, 2002). Les mécanismes par lesquels la nicotine exerce ses effets toxiques ne sont pas encore bien compris. L'un des mécanismes le plus communément proposé implique son rôle en tant qu'agent oxidatif (Argentin et Cicchetti, 2004). Selon Chang et coll. (2002), l'un des mécanismes possible de toxicité associé à la nicotine chez les fibroblastes serait la depletion en thiol (acide aminé contenant du soufre), dont le plus important est le glutathion. Le glutathion, le principal antioxydant naturellement présent dans les cellules, joue un rôle important dans la régulation et la régénération des cellules immunitaires ainsi que dans la detoxification de l'organisme. Une déficience en glutathion contribue donc au stress oxydatif impliqué dans le développement de plusieurs maladies (Wu^a/.,2004).

Après avoir mis en évidence les effets cytotoxiques de la nicotine seule, nous avons démontré qu'en combinaison avec le LPS d'A. actinomycetemcomitans, une bactérie à fort potentiel pathogénique et associée à la parodontite agressive, des effets cytotoxiques du type additif étaient obtenus. Plus précisément, le traitement combiné de la nicotine et du LPS était équivalent à la somme des effets toxiques pris individuellement. D'après notre analyse de la littérature, les résultats d'une telle combinaison sur la toxicité des cellules mucosales n'avaient encore jamais été rapportés.

Jusqu'à ce jour, plusieurs études scientifiques ont démontré les effets bénéfiques pour la santé des polyphenols que renferment les fruits, les légumes, le vin rouge et le thé vert. L'activité antioxydante des polyphenols représente un champ d'intérêt pour de nombreuses équipes de recherche. Il a été proposé que les antioxydants phénoliques seraient capable de neutraliser et réduire les dommages causés par les radicaux libres (Nijveldt et al, 2001) et ainsi, protéger l'organisme contre diverses maladies dégénératives et chroniques (Willcox et a l , 2004). De façon générale, les fruits de couleur foncée possèdent une capacité antioxydante élevée (Kalt et a l , 1999; Kalt et al, 2001). Les petits fruits, de couleur rouge et bleue/violette, constituent l'une des plus importantes sources de composés phytochimiques (Tabart et a l , 2006). Parmi ceux-ci, les anthocyanines apportent une contribution substantielle à leur capacité anti oxydante. Ce sont les anthocyanines qui procurent une couleur vive aux petits fruits. La structure chimique de base de toutes les anthocyanines est constituée par un système tricyclique aromatique à quinze atomes de carbone auquel sont liés des groupements hydroxyls, méthyls ou carbones (Nijveldt et al, 2001; Choi et al, 2007). Le déficit en électrons est à l'origine de la forte réactivité des anthocyanines envers les ROS (Galvano et al, 2004). Le cassis (Ribes nigrum) est un petit fruit de couleur noire violacée appartenant à la famille des Grossulariacées. Son pouvoir antioxydant provient de sa forte teneur en polyphenols de type anthocyanine (Moyer et al, 2002). Des études antérieures ont confirmé les propriétés antioxydantes (Kàhkônen et al, 2001; Tabart et al, 2006) et anti-inflammatoires (Declume, 1989; Watson et al, 1993) du

cassis. Plus particulièrement, le cassis est connu pour son activité anti-rhumatisme (Leventhal et al, 1994).

Dans cette étude, la capacité d'un extrait brut de cassis à neutraliser les effets cytotoxique et inflammatoire de la nicotine a été évaluée. Pour ce faire, les cellules épithéliales et les fibroblastes d'origine buccale ont été pré-traitées avec l'extrait brut de cassis avant d'être stimulées avec la nicotine. La viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide d'un test colorimétrique MTT alors que les cytokines sécrétées ont été dosées par un test ELISA. D'une part, il a été démontré qu'un pré-traitement avec un extrait brut de cassis (> 5 pg/ml) entraîne une neutralisation de manière dose-dépendante des effets cytotoxiques induits par la nicotine chez les cellules épithéliales et les fibroblastes gingivaux. D'autre part, il a été démontré que la nicotine augmentait la sécrétion de la chimiokine CCL5 par les cellules épithéliales buccales et qu'un pré-traitement avec l'extrait brut de cassis (> 5 pg/ml) réduisait cette production de CCL5. Ce résultat est en accord avec l'étude de Giannopoulou et coll. (2003) qui a démontré que les concentrations de cytokines inflammatoires retrouvées dans le liquide créviculaire gingival sont associées de façon positive avec le tabagisme. La CCL5 est une chimiokine ayant comme rôle principal l'activation cellulaire et la stimulation de la migration des leucocytes. Des quantités élevées de CCL5 ont été détectées dans le liquide créviculaire gingival ainsi que dans les tissus gingivaux enflammés adjacents aux poches parodontales, ce qui indique que cette chimiokine pourrait jouer un rôle important dans la pathogénèse de la parodontite (Gamonal et al, 2000; Gamonal et al, 2001).

Par la suite, l'effet cytoprotecteur des trois anthocyanines majeures du cassis, soit la cyanidine-3-glucoside, la cyanidine-3-rutinoside et la delphinidine-3-rutinoside, a été évalué. Les résultats obtenus ont démontré qu'un pré-traitement avec l'un ou l'autre de ces anthocyanines pures (> 5 pg/ml) entraîne une neutralisation de manière dose-dépendante des effets cytotoxiques induits par la nicotine tant chez les cellules épithéliales que chez les fibroblastes gingivaux. De plus, un pré-traitement par la cyanidine-3-glucoside (> 5 pg/ml) a aussi démontré une capacité à réduire la production de CCL5 par les cellules épithéliales.

D'autres études portant sur les anthocyanines supportent nos résultats. Par exemple, une étude menée par Russo et coll. (2005) a démontré que la cyanidine-3-glucoside a un effet cytoprotecteur contre les dommages induits par l'ochratoxine A, une mycotoxine ayant des propriétés carcinogénique, tératogénique et néphrotoxique chez les fibroblastes humains. Il a également été rapporté que la cyanidine-3-glucoside possède des activités chémopréventive et chémothérapeutique contre les dommages induits par les rayons ultraviolets B vis-à-vis la lignée cellulaire JB6 (Ding et a\., 2006) et les kératinocytes humains (Cimino et a l , 2006). Choi et coll. (2007) quant à eux, ont rapporté que les anthocyanines incluant la cyanidine-3-galactopyranoside, la cyanidine-3-glucopyranoside, la delphinidine-3-glucopyranoside, la malvidine-3-glucopyranoside, la pelagonine-3- glucopyranoside, la péonidine-3-glucopyranoside et la pétunidine-3-glucopyranoside, procurent une protection contre la toxicité induite par la doxorubicine, un agent cytotoxique effectif contre les cellules cancéreuses, chez les cardiomyocytes.

Outre les anthocyanines, d'autres polyphenols de la famille des flavonoïdes possèdent des propriétés antioxydantes importantes, notamment les catéchines. La principale source alimentaire de catéchine est le thé vert, obtenu à partir des feuilles de la plante Camellia sinensis. Il a été rapporté que le thé vert exerce des effets bénéfiques contre de nombreuses affections chroniques telles les maladies cardiovasculaires et le cancer, de même que contre diverses conditions systémiques (Cabrera et al, 2006). Plusieurs de ces effets bénéfiques ont été attribués à l'EGCG, la principale composante active du thé vert (Cabrera et al, 2006). Wu et Wei (2002) ont rapporté qu'une tasse de thé vert (2.5 g de feuilles de thé vert/200 ml d'eau) contient environ 90 mg d'EGCG. L'EGCG est une puissante molécule antioxydante qui a la capacité de protéger les cellules contre des dommages causés par les radicaux libres (Cabrera et a l , 2006).

Dans cette étude, la capacité de l'EGCG du thé vert à neutraliser les effets cytotoxique et inflammatoire de la nicotine a également été évaluée. Pour ce faire, les cellules épithéliales et les fibroblastes d'origine buccale ont été pré-traités avec l'EGCG avant d'être stimulés

pg/ml) neutralise de manière dose-dépendante les effets cytotoxiques induits par la nicotine chez les cellules épithéliales et les fibroblastes gingivaux. D'autre part, il a été démontré qu'un pré-traitement avec l'EGCG (> 5 pg/ml) réduit la sécrétion de la chimiokine CCL5 induite par la nicotine chez les cellules épithéliales buccales humaines. Dans la littérature, d'autres études ont également rapporté les effets cytoprotecteurs des polyphenols contenus dans le thé vert. Entre autre, Lee et coll. (2008) ont démontré que l'EGCG du thé vert atténue les effets cytotoxiques de l'éthanol sur les cellules hépatomes humaines. D'après ces chercheurs, l'effet cytoprotecteur observé pourrait être attribué à l'inhibition de la gamma-glutamyl transferase (GGT), une enzyme membranaire présente dans le foie qui catalyse le glutathion extracellulaire. Pour leur part, Shin et coll. (2009) ont rapporté qu'un extrait de thé vert offre un effet protecteur contre la toxicité induite par la L-arginine sur les cellules rénales mésangiales humaines.

Plusieurs études ont déjà rapporté une grande variété de propriétés bénéfiques associées à l'EGCG. Ainsi, il a été démontré que l'EGCG inhibe l'activité collagénase présente dans le liquide créviculaire gingival (Makimura et a l , 1993) de même que l'expression des MMPs chez les cellules tumorales murines (Isemura et al, 1999), les tissus de rat et de tumeurs de cerveau humain (Demeule et al, 2000) et les cellules humaines de fibrosarcome (Maeda-Yamamoto et al, 2003). De plus, l'EGCG a démontré in vitro une capacité à réduire la destruction osseuse induite par P. gingivalis lors des maladies parodontales en inhibant la production de MMPs par les cellules osseuses de l'hôte (Yun et al, 2004). Il a été rapporté que l'EGCG possède des propriétés antimicrobiennes contre de nombreuses bactéries, incluant les parodontopathogènes (Taylor et al, 2005). L'EGCG possède également une puissante activité anti-inflammatoire et anti-proliférative capable d'inhiber sélectivement la croissance des cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales. Syed et coll. (2007) ont montré que le pré-traitement par l'EGCG des cellules épithéliales bronchiques humaines primaires permet une inhibition significative de la prolifération cellulaire induite par la fumée de cigarette. Ainsi, leurs résultats démontrent que l'EGCG contribue à supprimer l'inflammation, la prolifération et la formation des vaisseaux sanguins induite par la fumée de cigarette.

Outre les anthocyanines et l'EGCG, d'autres polyphenols ont déjà démontré un effet cytoprotecteur contre la toxicité induite par la nicotine, notamment l'acide ellagique vis-à- vis les lymphocytes du sang périphérique (Sudheer et al, 2006) et l'épicatéchine vis-à-vis les cellules de la rétine neurosensorielle (Patil et al, 2009).

Dans la littérature, il a été rapporté que la nicotine engendre la production de radicaux libres et ainsi contribue majoritairement à l'établissement d'un stress oxydatif, en plus de réduire les mécanismes de défense antioxidatifs (Balakrishnan et Menon, 2007). Le possible mécanisme responsable de cet effet protecteur contre la cytotoxicité de la nicotine pourrait être lié à une réduction de la production et de l'accumulation des ROS dans les tissus parodontaux des patients fumeurs. Balakrishnan et Menon (2007) ont démontré que l'augmentation de radicaux libres induite par la nicotine peut être neutralisée par l'hespéridine, un flavanone retrouvé principalement dans la pelure d'agrumes. Shin et coll. (2009) quant à eux, ont suggéré comme mécanisme de cytoprotection du thé vert contre la toxicité induite par la L-arginine sur les cellules rénales mésangiales humaines, sa capacité à augmenter la bioactivité de la superoxyde dismutase (SOD) et du glutathion peroxydase (GSH-Px), des enzymes antioxydantes endogènes, ce qui a comme effet d'inactiver les radicaux libres générés tels fanion superoxyde (O2). De plus, puisque FO2" réagit avec le radical libre NO pour former du péroxynitrite (ONOO), les polyphenols du thé vert sont capables de réduire la perte de NO et ainsi maintenir la fonction physique du NO qui est une molécule oxydante dérivée de l'azote (Shi et al, 2001). Il a également été rapporté que les polyphenols du thé vert sont capable d'inhiber la synthèse de thromboxane A2 (TXA2) et de leucotriènes, des médiateurs de l'inflammation (Choi et al, 2002).

Tous les aliments ne sont pas égaux quant à leur richesse intrinsèque en polyphenols. Dans cette étude, le pouvoir antioxydant des polyphenols à l'étude ayant démontré une propriété cytoprotectrice contre les effets toxiques induits par la nicotine a été mesuré par le test de détermination de la capacité antioxydante totale. L'EGCG a présenté un indice TAC

donc un pouvoir antioxydant plus puissant que celui de l'extrait brut de cassis. Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés par Paganga et coll. (1999) qui ont comparé l'effet antioxydant de certains fruits et légumes. Ils ont rapporté que 2 tasses de thé équivalent à 3 Vi verres de jus de cassis.

En conclusion, cette étude in vitro amène des évidences claires que certains polyphenols dérivés de plantes et de petits fruits pourraient contribuer à réduire les problèmes parodontaux liés au tabagisme. Plus spécifiquement, certaines anthocyanines, pures ou présentes dans un extrait de cassis, de même que l'EGCG du thé vert, ont la capacité de neutraliser les effets cytotoxique et inflammatoire induits par la nicotine, lesquelles contribuent à la sévérité des maladies parodontales. Ainsi, l'ajout éventuel de tels polyphenols dans les produits d'hygiène buccale représente un moyen prometteur pour la prévention et le traitement des maladies parodontales. De ce fait, nos résultats suggèrent que l'extrait brut de cassis possède un potentiel d'application pour la santé parodontale.