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Capacité des polyphénols à neutraliser les effets cytotoxiques et inflammatoires de la nicotine sur les cellules épithéliales et les fibroblastes buccaux

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Academic year: 2021

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Texte intégral

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JACYNTHE DESJARDINS

CAPACITE DES POLYPHENOLS A

NEUTRALISER LES EFFETS CYTOTOXIQUES

ET INFLAMMATOIRES DE LA NICOTINE SUR

LES CELLULES ÉPITHÉLIALES ET LES

FIBROBLASTES BUCCAUX

Mémoire présenté

à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval dans le cadre du programme de Maîtrise en microbiologie

pour l'obtention du grade de Maître es sciences (M. Sc.)

DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE, DE MICROBIOLOGIE ET DE BIO-INFORMATIQUE

FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GÉNIE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

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Résumé

Dans cette étude, les effets toxiques de la nicotine, seule et en combinaison avec le lipopolysaccharide de bactéries parodontopathogènes, sur les cellules épithéliales et les fibroblastes d'origine buccale ont été déterminés. La capacité de polyphenols à neutraliser les effets cytotoxiques et inflammatoires de la nicotine a également été évaluée. Les cellules mucosales buccales ont été traitées avec la nicotine (± lipopolysaccharide), en présence et en absence de polyphenols. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide d'un test colorimétrique mesurant la respiration cellulaire alors que la sécrétion de cytokines a été déterminée par un test immuno-enzymatique. Il a été démontré que la nicotine cause une perte de viabilité cellulaire de manière dose-dépendante. Une combinaison de nicotine et de lipopolysaccharide a entraîné des effets cytotoxiques additifs. Certaines anthocyanines pures ou présentes dans un extrait de cassis de même que l'épigallocatéchine-3-gallate ont permis de neutraliser les effets cytotoxiques et inflammatoires induits par la nicotine. Les résultats de cette étude supportent le potentiel thérapeutique des polyphenols pour la maladie parodontale.

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Avant-propos

J'ai le plaisir de vous présenter ce mémoire, fruit de mes recherches en microbiologie et biologie buccale. Je suis reconnaissante à tous ceux et celles qui, tout au long de mon parcours, ont fourni une aide et un soutien attentionné.

Je désire tout d'abord remercier mon directeur de recherche, Dr Daniel Grenier. Merci Dr Grenier pour l'accueil chaleureux au sein de votre laboratoire et pour la confiance que vous m'avez prodiguée au cours des deux années passées parmi votre équipe. Merci aussi pour votre disponibilité, vos judicieux conseils, vos critiques constructives et votre appui continu, tous indispensables à la réalisation de ce projet de maîtrise. Vous avez été pour moi un pédagogue et un mentor sur lequel je pouvais toujours compter.

Je tiens également à remercier les membres de mon comité aviseur, Dre Fatiha Chandad et Dr Reginaldo Gonçalves. Vos suggestions et vos commentaires constructifs ont été essentiels à la réussite de ce travail.

Un merci spécial à tous mes collègues du GREB. Vos conseils scientifiques et techniques, de même que vos réflexions personnelles lors de mon apprentissage m'ont permis de grandir et d'élargir mes horizons. Merci également pour votre amitié précieuse.

Mes sincères remerciements vont à mes parents, ma sœur, mes frères, mon copain ainsi qu'à mes amis pour m'avoir appuyé dans cette initiative. Vos encouragements et votre appui m'ont permis de toujours persévérer et de réaliser un autre de mes rêves.

C'est grâce à vous tous que mon esprit scientifique s'est développé et que cette aventure a été pour moi l'une des plus enrichissantes.

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Table des matières

Résumé II Avant-propos III Table des matières IV Liste des figures VI Liste des tableaux VIII Liste des abréviations IX

1 Introduction 1 1.1 Maladies parodontales 1

1.1.1 Parodonte sain 1 1.1.1.1 Tissus parodontaux 1 1.1.1.1.1 Gencive et muqueuse alvéolaire 2

1.1.1.1.1.1 Fluide créviculaire gingival 5

1.1.1.1.2 Ligament parodontal 5

1.1.1.1.3 Cément 6 1.1.1.1.4 Os alvéolaire 6 1.1.1.2 Microflore normale 6 1.1.1.3 Réponse immunitaire 7 1.1.1.3.1 Réponse immunitaire non spécifique 8

1.1.1.3.2 Réponse immunitaire spécifique 9

1.1.2 Parodonte pathologique 10 1.1.2.1 Définition 10 1.1.2.1.1 Gingivite 10 1.1.2.1.2 Parodontite 11 1.1.2.2 Classification 11 1.1.2.3 Étiopathogenèse 14 1.1.2.3.1 Biofilm dentaire 14 1.1.2.3.2 Bactéries parodontopathogènes 16

1.1.2.3.3 Facteurs bactériens de virulence 18

1.1.2.3.3.1 Lipopolysaccharide 18 1.1.2.3.4 Réponse immunodestructrice de l'hôte 19

1.1.2.4 Epidemiologic 20 1.1.2.4.1 Prévalence et incidence 20

1.1.2.4.2 Facteurs de risque 20 1.2 Tabagisme et maladies parodontales 22

1.2.1 Fumée de cigarette 22 1.2.2 Pipe et cigare 23 1.2.3 Microflore sous-gingivale 23

1.2.4 Réponse immunodestuctrice de l'hôte 23

1.2.5 Nicotine 24 1.2.6 Mécanismes oxydatifs 25

1.3 Polyphenols 26 1.3.1 Définition 27 1.3.1 Mécanismes antioxydatifs 29

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1.4 Problématique 31 1.4.1 Hypothèse de recherche 31

1.4.2 Objectifs de la recherche 31

2 Matériel et méthodes 32 2.1 Culture bactérienne et préparation du lipopolysaccharide 32

2.2 Produits chimiques 32 2.3 Conditions de culture des cellules épithéliales et des fibroblastes d'origine

buccale 33 2.4 Traitement des cellules épithéliales et des fibroblastes et détermination de la

viabilité cellulaire 34 2.5 Traitement des cellules épithéliales et dosage des cytokines sécrétées 35

2.6 Pouvoir antioxydant 36 2.7 Analyses statistiques 36

3 Résultats 37 3.1 Activités cytotoxiques de la nicotine et du lipopolysaccharide de bactéries

parodontopathogènes vis-à-vis les cellules épithéliales et les fibroblastes 37 3.2 Propriété cytoprotectrice de polyphenols vis-à-vis les effets toxiques de la

nicotine 45 3.3 Propriété anti-inflammatoire de polyphenols vis-à-vis les cellules épithéliales

exposées à la nicotine 58 3.4 Pouvoir anti oxydant 62

4 Discussion 63 Bibliographie 71

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Liste des figures

Figure 1 : Représentation schématique de la dent et du parodonte sain 1 Figure 2 : Représentation schématique d'une coupe histologique décrivant la composition

de la gencive et la zone de contact entre la gencive et l'émail 3 Figure 3 : Modèle actuellement accepté de la maladie parodontale 10 Figure 4 : Stades de la formation et du développement du biofilm dentaire résultant de

l'accumulation hétérogène de bactéries aérobies et anaérobies, se multipliant au sein d'une

matrice intercellulaire d'origine microbienne et salivaire 15 Figure 5 : Diagramme présentant les complexes bactériens de Socransky 17

Figure 6 : Structure moléculaire des classes principales des flavonoïdes 27 Figure 7a : Effets de concentrations croissantes de nicotine sur la viabilité des cellules

épithéliales buccales humaines GMSM-K 39 Figure 7b : Effets de concentrations croissantes de nicotine sur la viabilité des fibroblastes

gingivaux humains HGF-1 40 Figure 8a : Effets de concentrations croissantes du LPS (VA. actinomycetemcomitans et de

P. gingivalis sur la viabilité des cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K 41 Figure 8b : Effets de concentrations croissantes du LPS d'A. actinomycetemcomitans et de

P. gingivalis sur la viabilité des fibroblastes gingivaux humains HGF-1 42 Figure 9a : Effets de diverses concentrations de nicotine et du LPS d'A.

actinomycetemcomitans (5 pg/ml) sur la viabilité des cellules épithéliales buccales

humaines GMSM-K 43 Figure 9b : Effets de diverses concentrations de nicotine et du LPS d'A.

actinomycetemcomitans (5 ug/ml) sur la viabilité des fibroblastes gingivaux humains

HGF-1 44 Figure 10a : Effets du pré-traitement avec un extrait brut de cassis sur la viabilité des

cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine 48 Figure 1 Ob : Effets du pré-traitement avec un extrait brut de cassis sur la viabilité des

fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine 49 Figure 1 la : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-glucoside sur la viabilité des

(7)

Figure 1 lb : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-glucoside sur la viabilité des

fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine 51 Figure 12a : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-rutinoside sur la viabilité des

cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine 52 Figure 12b : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-rutinoside sur la viabilité des

fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine 53 Figure 13a : Effets du pré-traitement avec la delphinidine-3-rutinoside sur la viabilité des

cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine 54 Figure 13b : Effets du pré-traitement avec la delphinidine-3-rutinoside sur la viabilité des

fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine 55 Figure 14a : Effets du pré-traitement avec Fépigallocatéchine-3-gallate (EGCG) sur la

viabilité des cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine 56 Figure 14b : Effets du pré-traitement avec l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) sur la

viabilité des fibroblastes gingivaux humains HGF-1 exposés à la nicotine 57 Figure 15 : Effets du pré-traitement avec un extrait brut de cassis sur la sécrétion de CCL5

par les cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine (50

pg/ml) 59 Figure 16 : Effets du pré-traitement avec la cyanidine-3-glucoside sur la sécrétion de CCL5

par les cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la nicotine (50

pg/ml) 60 Figure 17 : Effets du pré-traitement avec l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) sur la

sécrétion de CCL5 par les cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K exposées à la

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Liste des tableaux

Tableau 1 : Classification des maladies parodontales révisée en 1999 par l'Académie

Américaine de Parodontologie (APP) 13 Tableau 2 : Classification des principaux flavonoïdes 28

Tableau 3 : Résultats du criblage d'une variété de polyphenols en regard de leur propriété de cytoprotection vis-à-vis les effets toxiques de la nicotine sur les cellules épithéliales 47

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Liste des abréviations

a Alpha 6 Bêta °C Degré Celcius ug Microgramme % Pourcent

AAP Académie Américaine de Parodontologie ATCC American Type Culture Collection CCL5 (C-C motif) ligand 5

C02 Dioxyde de carbone

CPITN Indice communautaire des besoins en traitements parodontaux DMEM Milieu de Eagle modifié par Dulbecco

DNase Désoxyribonucléase

EDTA Acide éthylènediaminetétraacétique EGCG Épigallocatéchine-3 -gallate

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FBS Sérum de veau fœtal

g Gramme

GGT Gamma-glutamyl transferase GSH-Px Glutathion peroxydase

H2 Hydrogène

HGF Fibroblastes gingivaux humains

Ig Immunoglobuline

IL Interleukine

iNOS Oxyde nitrique synthase inductible

LPS Lipopolysaccharide mg Milligramme ml Millilitre mm Millimètre mM Millimolaire MMP Métalloprotéinase matricielle

MTT Bromure de 3-[4, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium

N2 Azote

NDM Matériel non dialysable

ng Nanogramme nm Nanometre NO Oxyde nitrique 02 Oxygène 02 Anion superoxyde ONOO Peroxynitrite

OMS Organisation mondiale de la santé

PAC Proanthocyanidine

PEA Pellicule exogène acquise PBS Tampon phosphate salin

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PMN Leucocyte polymorphonucléaire pg Picogramme PGE2 Prostaglandine E2

RANTES Regulated on Activation Normal T cell Exposed and Secreted RNase Ribonuclease

ROS Radicaux libres oxygénés SOD Superoxyde dismutase TAC Capacité antioxydante totale

Trolox Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique THB Milieu Todd-Hewitt

TNF Facteur nécrosant des tumeurs

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1 Introduction

1.1 Maladies parodontales

1.1.1 Parodonte sain

1.1.1.1 Tissus parodontaux

Le parodonte représente l'ensemble des tissus de soutien des dents. Il est constitué par les tissus qui entourent la dent et qui l'ancrent dans la mâchoire. Le parodonte est divisé en deux parties : le parodonte superficiel qui comprend la gencive et le parodonte profond qui est composé du ligament parodontal (ou ligament alvéolo-dentaire ou desmodonte), du cément et de l'os alvéolaire (figure 1). Les fonctions principales du parodonte sont de fixer la dent à l'os de la mâchoire et de maintenir l'intégrité de la surface de la muqueuse de la cavité buccale (Hassell, 1993; Lindhe et a l , 2003).

Gencive Ligament parodontal

Cément-Os alvéolaire—^

&&ztâ&

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1.1.1.1.1 Gencive et muqueuse alvéolaire

La gencive fait partie de la muqueuse buccale et constitue la partie visible du parodonte (Hassell, 1993). Elle entoure le collet de la dent tout en recouvrant l'os alvéolaire. La gencive est largement vascularisée et innervée. Sa fonction principale est de protéger le parodonte des microorganismes et des substances toxiques de la cavité buccale (Bercy et al., 1996). La gencive est composée de deux parties : la gencive libre (ou marginale) et la gencive attachée (ou adhérente). La gencive libre, de couleur rose corail et de consistance ferme, est située autour de la dent sans y être attachée (Hassell, 1993). Le repli retrouvé entre la gencive libre et la surface de la dent forme le sulcus gingival (ou sillon gingival ou sillon gingivo-dentaire), communément appelé poche parodontale lors de la présence d'une maladie parodontale. Il contient en permanence le fluide créviculaire gingival (Mattout et Mattout, 2003). L'insertion d'une sonde parodontale graduée, entre la surface de la dent et la portion marginale de la gencive libre permet de mesurer la profondeur du sulcus gingival qui se situe à l'état sain entre 0.5 et 3 mm. La gencive attachée est, quant à elle, le prolongement de la gencive libre. Elle est fermement attachée au cément et à l'os alvéolaire sous-jacent et présente une texture de « pelure d'orange » (Hassell, 1993; Lindhe et al, 2003).

Du point de vue histologique, la gencive possède une composante épithéliale et une autre conjonctive. L'épithélium gingival est composé de trois types d'épithélium: l'épithélium buccal, l'épithélium sulculaire et l'épithélium de jonction (ou jonctionnel) (figure 2). L'épithélium buccal recouvre les gencives libre et attachée. Il est stratifié et kératinisé. L'épithélium buccal est composé de quatre couches cellulaires : la couche basale (stratum germinativum), la couche épineuse (stratum spinosum), la couche granuleuse (stratum granulosum) et la couche cornée (stratum corneum). Sa surface est constituée de kératinocytes (cellules qui produisent la kératine) (90%), de melanocytes (cellules qui synthétisent des pigments de mélanine) et de cellules de Langerhans (cellules qui jouent un rôle dans les mécanismes de défense de la muqueuse buccale) (Hassell, 1993; Lindhe et al, 2003). Il faut environ 10 jours pour que les cellules traversent l'épithélium buccal (Hassel,

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cuboïdes s'aplatissent. À la surface, les cellules mortes sont éliminées dans le sulcus gingival avec le fluide créviculaire (Mattout et Mattout, 2003). L'épithélium sulculaire pour sa part, représente la partie interne de l'épithélium gingival non attachée à la surface de la dent. Il est donc en contact constant avec le biofilm dentaire sous-gingival. Cet epithelium, pluristratifié et non kératinisé, comprend également les quatre couches cellulaires épithéliales (Hassel, 1993). Quant à l'épithélium de jonction, il est composé de quelques couches de cellules épithéliales interposées entre l'émail et le tissu conjonctif gingival sous-jacent (Charon et Mouton, 2003). Il est non kératinisé et non différencié. Sa desquamation est de 50 à 100 fois plus rapide que celle de l'épithélium buccal. L'épithélium de jonction assure l'adhésion du parodonte à la dent (Hassel, 1993).

Epithelium sulculaire

Epithelium de jonction

Tissu conjonctif

Epithelium buccal

Os alvéolaire

Figure 2 : Représentation schématique d'une coupe histologique décrivant la composition de la gencive et la zone de contact entre la gencive et l'émail (tirée et adaptée de Lindhe et al, 2003).

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Le tissu conjonctif (ou lamina propria) est le tissu prédominant de la gencive (figure 2). Il assure la protection du parodonte profond. Le tissu conjonctif gingival est composé de fibres de collagène (environ 60%), de cellules (8%) et de vaisseaux et nerfs incorporés dans une matrice extracellulaire (35%). Les cellules retrouvées dans le tissu conjonctif gingival sont : les fibroblastes et les cellules de défense, soit les cellules myéloïdes (monocytes, macrophages, leucocytes polymorphonucléaires (PMN), les cellules lymphoïdes (lymphocytes T, B et plasmocytes) et les mastocytes (Hassell, 1993; Charon et Mouton, 2003; Lindhe et al, 2003). Les fibroblastes gingivaux sont les principales cellules de ce tissu conjonctif. Ce sont des cellules fusiformes allongées ou en étoile, situées entre les fibres de collagène. Ces fibroblastes sont impliqués dans la synthèse et la destruction des fibres et de la matrice extracellulaire du tissu conjonctif. Les fibres du tissu conjonctif gingival sont les fibres de collagène, les fibres de réticuline, les fibres oxytalanes et les fibres élastiques. Les fibres de collagène sont les fibres prédominantes dans le tissu conjonctif gingival et elles constituent la composition essentielle du parodonte. La matrice extracellulaire représente le milieu dans lequel les cellules du tissu conjonctif baignent et où les transports d'eau, d'électrolytes, de nutriments et de metabolites ont lieu. Les fibroblastes gingivaux sont également impliqués dans la réponse immunitaire inflammatoire en répondant à des stimuli qui proviennent des médiateurs de l'inflammation produits et sécrétés par les cellules de l'hôte ou alors des bactéries associées à la maladie parodontale (Hassell, 1993; Charon et Mouton, 2003; Lindhe et al, 2003).

La muqueuse alvéolaire est quant à elle, de couleur plutôt rougeâtre en raison de sa grande vascularisation. Elle est en continuité avec la peau des lèvres et avec la muqueuse du palais mou et du pharynx. Histologiquement, la muqueuse alvéolaire est composée d'un epithelium non kératinisé et d'un tissu conjonctif riche en fibres élastiques (Hassell, 1993; Lindhe et al, 2003).

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1.1.1.1.1.1 Fluide créviculaire gingival

Le fluide créviculaire gingival se définit comme le liquide qui s'écoule continuellement à travers le sulcus gingival. Il est estimé que ce fluide se renouvelle environ 40 fois par heure (Mattout et Mattout, 2003). Le fluide créviculaire contient des cellules épithéliales desquamées, des leucocytes (PMN, lymphocytes, monocytes, macrophages), des plasmocytes et des éléments bactériens provenant de la plaque sous-gingivale, de même que des protéines (albumine, globulines et fibrinogène) et des enzymes (proteases, collagénases, phosphatases, hyaluronidase, lysozyme) (Bercy et al, 1996; Charon et Mouton, 2003). Les PMN représentent environ 95% des cellules du fluide créviculaire. Sa composition dépend entre autre de plusieurs facteurs liés à la santé du parodonte et de l'individu (Mattout et Mattout, 2003). Malgré le fait que le fluide gingival permet une certaine défense de l'organisme contre l'agression bactérienne, il ne suffit pas pour empêcher l'apparition de la maladie parodontale. En effet, il est plutôt une conséquence du développement de la maladie (Bercy et al, 1996).

1.1.1.1.2 Ligament parodontal

Le ligament parodontal est un tissu conjonctif fibreux qui comble l'espace existant entre la racine dentaire et l'os alvéolaire (figure 1). Il assure la fixation de la dent dans son alvéole par son ancrage sur le cément et absorbe les forces de la mastication et d'autres mouvements buccaux (Mattout et Mattout, 2003). Les cellules ligamentaires les plus nombreuses sont les fibroblastes (65%) qui ont comme fonction la synthèse et la dégradation du collagène (Charon et Mouton, 2003). Le ligament parodontal est richement vascularisé et innervé (Bercy et al„ 1996; Mattout et Mattout, 2003).

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1.1.1.1.3 Cément

Le cément est une mince couche de tissu minéralisé qui entoure la racine en recouvrant la dentine radiculaire (figure 1) (Mattout et Mattout, 2003). Du point de vue histologique, il se présente sous deux formes : le cément acellulaire adjacent à la dentine et le cément cellulaire qui le recouvre. Le cément est formé d'une matrice organique principalement constituée de collagène, de sels minéraux (surtout de cristaux d'hydroxy apatite) et d'eau. Il permet l'ancrage des fibres du ligament parodontal à la racine de la dent (Charon et Mouton, 2003). Le cément est dépourvu de vaisseaux sanguins et de nerfs (Bercy et al,

1996; Mattout et Mattout, 2003).

1.1.1.1.4 Os alvéolaire

L'os alvéolaire est la principale structure de soutien de l'organe dentaire. Il apporte une certaine rigidité au parodonte et assure la fixation des fibres parodontales (figure 1). L'os alvéolaire contient des alvéoles dentaires, celles-ci ayant comme fonction de loger les racines dentaires (Bercy et al, 1996, Mattout et Mattout, 2003). Ces alvéoles dentaires sont formées d'une corticale (os compact) externe et entre elles se trouve l'os spongieux médian. L'os alvéolaire est un tissu conjonctif minéralisé qui présente de nombreuses perforations à travers lesquelles passent les vaisseaux sanguins et les fibres nerveuses (Charon et Mouton, 2003).

1.1.1.2 Microflore normale

La cavité buccale constitue l'un des écosystèmes microbiens les plus complexes du corps humain. À ce jour, au-delà de 700 espèces bactériennes différentes ont été rapporté dans la cavité buccale (Aas et al, 2005). Ces bactéries sont classées en deux grands groupes en fonction de la structure de leurs parois : bactéries à Gram positif et bactéries à Gram

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négatif. Le parodonte sain est colonisé par des bactéries aérobies strictes ou anaérobies facultatives à Gram positif à prédominance d'actinomycètes et de streptocoques (85%) et de bactéries anaérobies strictes à Gram négatif (15%) (Slots, 1977). De façon générale, ces microorganismes vivent en harmonie avec l'hôte. Une modification de la flore bactérienne indigène peut mener au développement de la parodontite.

1.1.1.3 Réponse immunitaire

Le corps humain est continuellement exposé à des microorganismes, à leurs produits et à d'autres molécules ayant un pouvoir toxique ou pathogénique. Par conséquent, l'organisme est muni d'un système immunitaire qui offre une protection contre les conséquences néfastes de cette exposition. Ainsi, dans la cavité buccale, l'ensemble des moyens de défense ont pour but de maintenir l'équilibre (homéostasie) entre les bactéries du biofilm dentaire et l'intégrité des tissus parodontaux. Les cellules responsables de cette immunité sont les leucocytes (lymphocytes [B, T et cellules tueuses naturelles], monocytes, macrophages, granulocytes, mastocytes). Il existe deux types de réponse immunitaire : la réponse immunitaire non spécifique (ou immunité innée) et la réponse immunitaire spécifique (ou immunité acquise). Ces deux types de réponses agissent d'une façon complémentaire pour éliminer les microorganismes pathogènes et leurs produits. En fait, les cytokines, des protéines solubles sécrétées par les cellules et qui agissent comme molécules de signalisation, sont nécessaires à l'immunorégulation de ces deux types de réponses immunitaires (Lindhe et al, 2003). Elles sont groupées en catégories selon leur fonction : les chimiokines, les interleukines (IL), les hématopoïétines et les membres de la famille du facteur nécrosant des tumeurs (TNF) (Prescott et al, 2003).

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1.1.1.3.1 Réponse immunitaire non spécifique

La réponse immunitaire non spécifique offre une résistance face à tous les microorganismes ou corps étrangers rencontrés dans l'hôte. Elle implique des mécanismes généraux innés et agit comme première ligne de défense. La réponse immunitaire non spécifique n'a pas de mémoire immunologique, c'est-à-dire qu'elle réagit avec la même ampleur à chaque rencontre avec un microorganisme ou un antigène.

Les mécanismes de défense immunitaire non spécifique, associés aux sécrétions de l'hôte, constituent la première ligne de défense contre les microorganismes (Prescott et a l , 2003). La protection des tissus parodontaux est d'abord assurée par les muqueuses buccales ayant un rôle essentiel de barrière physique vis-à-vis la colonisation microbienne. La capacité de l'épithélium à desquamer permet d'éliminer les bactéries qui adhèrent à la surface des muqueuses (Charon et Mouton, 2003). À l'opposé, les dents offrent des surfaces dures non desquamantes, ainsi idéales pour le développement de vastes dépôts bactériens appelés plaque dentaire. Le flux salivaire présente alors deux types d'action sur l'écosystème buccal : une barrière mécanique nettoyante et une barrière chimique par ses différents composants antibactériens (lysozyme, lactoferrine, peroxydase, histamine, etc.) (Darveau et a l , 1997; Mattout et Mattout, 2003).

L'inflammation est une réaction immunitaire non spécifique qui se développe à la suite d'une lésion tissulaire produite par un agent pathogène. La réaction inflammatoire débute dès que les cellules du tissu lésé libèrent des médiateurs de l'inflammation. Les signes classiques d'une inflammation sont les suivants : rougeur, chaleur, douleur, formation d'un œdème et altération de la fonction. La réponse inflammatoire peut être aigiie ou chronique (Prescott et al, 2003).

Le système du complément joue également un rôle majeur dans la réponse immunitaire non spécifique. Il est composé de protéines sériques capable de mener à une lyse des cellules et des bactéries via la voie classique alternative ou des lectines. Le complément est un médiateur de l'inflammation; il attire et active les cellules phagocytaires (monocytes, macrophages et neutrophiles). Ces dernières représentent une ligne de défense précoce

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importante puisqu'elles reconnaissent, ingèrent et tuent les microorganismes par phagocytose (Prescott et al, 2003). Plus précisément, les PMN jouent un rôle important dans la phagocytose puisqu' ils possèdent à leur surface des récepteurs spécifiques pour un certain nombre de molécules synthétisées par les bactéries et les cellules de l'hôte. Les PMN jouent donc un rôle crucial dans la défense des tissus parodontaux.

1.1.1.3.2 Réponse immunitaire spécifique

La réponse immunitaire spécifique permet de développer une résistance face à un agent étranger. Cette résistance s'accroît au fur et à mesure des expositions répétées à l'agent. Les trois fonctions principales de cette immunité sont : reconnaître tout ce qui est étranger (antigène), y répondre efficacement et exercer une réponse mémoire. Une fois l'antigène reconnu, le système immunitaire répond en recrutant les cellules et les molécules qui vont l'attaquer. Si cet antigène est rencontré de nouveau, le système immunitaire le reconnaîtra et développera une réponse mémoire plus rapide et plus intense, ce qui éliminera l'agent agresseur et par conséquent, protégera l'hôte. Il existe deux types de réponse immunitaire spécifique : l'immunité humorale et l'immunité cellulaire. L'immunité humorale fait intervenir les anticorps (ou immunoglobulines [Ig]) qui se fixent aux antigènes puis les neutralisent ou les marquent pour les destiner à la destruction par d'autres mécanismes (Prescott et al, 2003). Les IgA sont les principales composantes immunitaires solubles contenues dans la salive. Ces glycoprotéines jouent un rôle protecteur en résistant à la protéolyse par des enzymes bactériennes, en inhibant l'activité enzymatique de certaines bactéries et en participant au contrôle de la colonisation bactérienne (Mattout et Mattout, 2003). Pour sa part, l'immunité à médiation cellulaire repose sur l'action des lymphocytes T qui attaquent directement les cellules infectées puis les lysent ou sécrètent des cytokines qui à leur tour, induiront l'inflammation ou la phagocytose (Prescott et al, 2003).

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1.1.2 Parodonte pathologique

1.1.2.1 Définition

Les maladies parodontales sont des pathologies buccales d'origine multifactorielle (figure 3). Elles sont caractérisées par une infection polymicrobienne et une réaction inflammatoire affectant le parodonte. Elles englobent deux types d'infections : la gingivite et la parodontite. AnticorDE AnticorDE

I

V Bactéries Réponse inflammatoire et immunitaire de l'hôte Cytokines Tissu conjonctif et métabolisme osseux Début progression de la maladie Bactéries PMNs Réponse inflammatoire et immunitaire de l'hôte Cytokines Tissu conjonctif et métabolisme osseux Début progression de la maladie Bactéries PMNs Réponse inflammatoire et immunitaire de l'hôte et prostanoide Tissu conjonctif et métabolisme osseux Début progression de la maladie Bactéries Antigènes Réponse inflammatoire et immunitaire de l'hôte et prostanoide Tissu conjonctif et métabolisme osseux Début progression de la maladie Bactéries Antigènes Réponse inflammatoire et immunitaire de l'hôte et prostanoide Tissu conjonctif et métabolisme osseux Début progression de la maladie Bactéries LPS et facteurs Réponse inflammatoire et immunitaire de l'hôte et prostanoide Tissu conjonctif et métabolisme osseux Début progression de la maladie Bactéries LPS et facteurs Réponse inflammatoire et immunitaire de l'hôte MMPs Tissu conjonctif et métabolisme osseux Début progression de la maladie Bactéries de virulence Réponse inflammatoire et immunitaire de l'hôte MMPs Tissu conjonctif et métabolisme osseux Début progression de la maladie i i de virulence

t

n A i

Facteurs de risque génétiques i

Figure 3 : Modèle actuellement accepté de la maladie parodontale (tiré de Mattout et Mattout, 2003).

1.1.2.1.1 Gingivite

La gingivite est définie comme une inflammation limitée à la gencive libre. Elle est causée par l'accumulation de plaque bactérienne non spécifique (flore mixte) à la jonction dent/gencive. La gingivite se manifeste par des rougeurs et de l'œdème au niveau des

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gencives, ainsi que par un saignement gingival lors du brossage des dents ou du sondage. Ces signes cliniques sont réversibles, c'est-à-dire que les gencives peuvent retrouver leur état normal sain si la plaque dentaire est éliminée. Les expériences classiques menées par Loe et coll. (1965) et Theilade et coll. (1966) sur la « gingivite expérimentale » chez l'homme ont clairement démontré que l'accumulation de bactéries sur les dents induit une réponse inflammatoire des tissus gingivaux. L'élimination de cette plaque mène à la disparition des signes cliniques de l'inflammation. En absence de traitement, les bactéries de la plaque peuvent envahir et coloniser les tissus du parodonte. La gingivite risque alors d'évoluer en parodontite (Listgarten, 1986).

1.1.2.1.2 Parodontite

La parodontite est une maladie inflammatoire chronique d'origine bactérienne qui affecte l'ensemble des tissus de soutien des dents. Elle se caractérise par une destruction progressive de l'os alvéolaire, du ligament parodontal et du cément et mène à une perte d'attache conjonctive. Les signes cliniques associés à cette perte d'attache sont : la présence de poches parodontales et/ou de récessions gingivales, de mobilités dentaires anormales ainsi que la perte prématurée de dents (Listgarten, 1986). La parodontite résulte de la réponse immunitaire exagérée de l'hôte vis-à-vis les bactéries de la plaque et les tissus nécrosés.

1.1.2.2 Classification

La classification des maladies parodontales est en constante évolution en raison de l'acquisition de nouveaux concepts et de données récentes en parodontologie. Jusqu'en

1999, la classification acceptée était celle agréée lors de l'Atelier mondial en parodontic clinique tenu en 1989. À Y International Workshop for a Classification of Periodontal

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été révisé et une nouvelle classification (tableau 1) fut alors adoptée par l'Académie Américaine de Parodontologie (AAP). Les maladies parodontales sont actuellement catégorisées selon la cause, la sévérité et la localisation de la maladie (Armitage, 1999). Cette classification est plus précise, principalement parce que ses critères de diagnostic sont clairs; elle réduit ainsi le chevauchement existant entre les différentes catégories de maladie, et elle simplifie la classification des patients dans des catégories plus appropriées. Les experts distinguent maintenant les maladies gingivales induites par la plaque bactérienne et celles qui ne sont pas induites par la plaque. Les parodontites peuvent quant à elles être chroniques, agressives, d'origine systémique, nécrotiques, entraînant la formation d'abcès du parodonte, associées à des lésions endodontiques ou développementales (acquises) (Wiebe et Putnins, 2000).

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Tableau 1 : Classification des maladies parodontales révisée en 1999 par l'Académie Américaine de Parodontologie (APP) (tiré et adapté de Wiebe et Putnins, 2000).

I. Maladies gingivales

A. Maladies gingivales induites par la plaque dentaire B. Maladies gingivales non induites par la plaque dentaire II. Parodontites chroniques

A. Localisées

B. Généralisées (> 30% des sites sont atteints) III. Parodontites agressives

A. Localisées

B. Généralisées (> 30% des sites sont atteints) IV. Parodontites associées à des maladies systémiques

A. Parodontites associées à des désordres hématologiques B. Parodontites associées à des désordres génétiques C. Parodontites d'origine non déterminée

V. Maladies parodontales nécrotiques A. Gingivite ulcéro-nécrotique B. Parodontite ulcéro-nécrotique

VI. Maladies parodontales entraînant la formation d'abcès du parodonte A. Abcès gingival

B. Abcès parodontal C. Abcès péricoronaire

VII. Parodontites associées à des lésions endodontiques A. Lésions endo-parodontales combinées

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1.1.2.3 Etiopathogenèse

1.1.2.3.1 Biofilm dentaire

La plaque dentaire consiste en un biofilm bactérien, c'est-à-dire une association de communautés bactériennes, adhérant à une surface, au sein d'une matrice polysaccharidique sécrétée par les bactéries elles-mêmes (Darveau et al, 1997; Mattout et Mattou, 2003). La formation du biofilm dentaire implique une capacité des bactéries à coloniser les surfaces dentaires. Le premier stade du développement du biofilm dentaire est la formation naturelle et spontanée, à la surface de l'émail, d'une pellicule exogène acquise (PEA) amicrobienne dans les minutes qui suivent le brossage (figure 4, stade 1). Cette pellicule, constituée principalement par des glycoprotéines salivaires (98%), agit comme substrat pour l'adhésion des espèces bactériennes pionnières (Darveau et al, 1997; Lindhe et al, 2008). Le deuxième stade du développement du biofilm consiste en la fixation de ces colonisateurs précoces sur les récepteurs de la PEA, au niveau supra-gingival, grâce à des adhésines de surface (figure 4, stade 2). Seules quelques espèces bactériennes, principalement des streptocoques et des actinomycètes ont la capacité de s'y fixer (Darveau et al, 1997; Lindhe et al, 2008). Ultérieurement, par la multiplication de ces bactéries déjà résidantes et la fixation de nouvelles espèces bactériennes telles des bactéries à Gram négatif, les microcolonies augmentent en volume, se fusionnent et saturent toute la surface de l'émail (figure 4, stade 3). Les bactéries synthétisent une matrice d'exopolysaccharides qui constitue une barrière difficile à pénétrer par les cellules du système de défense de l'hôte et les facteurs d'inhibition présents dans la salive. Avec l'arrivée de nouveaux microorganismes anaérobies stricts à Gram négatif, les colonisateurs tardifs ou secondaires, l'hétérogénéité du biofilm dentaire augmente et par conséquent, celui-ci se développe en épaisseur (figure 4, stade 4) (Darveau et a l , 1997; Lindhe et a l , 2008). Les bactéries constituent donc l'élément qui domine la plaque dentaire; 1 mg de plaque dentaire contient plus de 108 bactéries (Lindhe et al, 2008). Le biofilm dentaire est la conséquence de

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mou non minéralisé adhérant fermement à la surface des dents. La plaque dentaire une fois minéralisée est appelée le tartre dentaire (Lindhe et al, 2008).

a

x'V

&L

-^x^Zliisxw^M-Surface dentaire Formation d'une pellicule exogène acquise (Stade 1) Fixation des espèces bactériennes pionnières (Stade 2) Multiplication des bactéries (Stade 3) Formation des microcolonies et arrivée des espèces bactériennes secondaires (Stade 4) Figure 4 : Stades de la formation et du développement du biofilm dentaire résultant de l'accumulation hétérogène de bactéries aérobies et anaérobies, se multipliant au sein d'une matrice intercellulaire d'origine microbienne et salivaire (tirée et adaptée de Lindhe et al, 2008).

La plaque dentaire est classifiée selon deux types principaux : la plaque supra-gingivale et la plaque sous-gingivale. La plaque supra-gingivale, retrouvée sur la couronne dentaire, est baignée par la salive alors que la plaque sous-gingivale, retrouvée sur la racine dentaire, est baignée par le fluide créviculaire gingival. L'environnement supra-gingival est principalement aérobie tandis que l'environnement sous-gingival est exempt d'oxygène (Darveau et a l , 1997; Charon et Mouton, 2003).

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1.1.2.3.2 Bactéries parodontopathogènes

Si la grande majorité des bactéries de la plaque dentaire n'ont que peu ou pas de pouvoir pathogène, certaines espèces, appelées parodontopathogènes, ont cependant un rôle pathologique prépondérant vis-à-vis des tissus parodontaux. L'accumulation et la prolifération de ces espèces bactériennes, principalement des anaérobies strictes à Gram négatif, présentes dans le biofilm dentaire sous-gingival, constitue le facteur étiologique primaire responsable du déclenchement de la parodontite. Parmi ces bactéries pathogènes, mentionnons Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum, Streptococcus intermedins, Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum, Eubacterium nodatum et Eikenella corrodens (Haffajee et Socransky, 1994; Socransky et al, 1998). A. actinomycetemcomitans et P. gingivalis sont les bactéries parodontopathogènes qui ont été les plus étudiées. A. actinomycetemcomitans est associée à la parodontite agressive alors que P. gingivalis est considérée comme l'agent étiologique majeur de la parodontite chronique (Slots et Listgarten, 1988).

Des études menées par Socransky et coll. (1998; 2002; 2005) ont démontré que des groupes d'espèces bactériennes, et non une seule espèce, sont impliqués dans le développement de la parodontite. Le regroupement spécifique des bactéries en complexes bactériens (figure 5) est représentatif des différents stades de la maladie et donc, de la sévérité de l'affection. Le concept de complexes bactériens repose sur la notion suivante : lorsque la présence d'une bactérie est détectée, les autres bactéries du même complexe seront probablement aussi présentes. Le « complexe jaune » inclut uniquement des espèces du genre Streptococcus. Le « complexe vert » est constitué d'espèces appartenant au genre Capnocytophaga, et des espèces E. corrodens, Campylobacter concisus et A. actinomycetemcomitans serotype a. Le « complexe violet » est composé des espèces

Veillonella parvula et Actinomyces odontolyticus. Ces trois complexes, en plus du groupe des Actinomyces, constituent les colonisateurs primaires de la surface dentaire.

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Le « complexe orange » comprend les sous-espèces de F. nucleatum, Campylobacter gracilis, C. rectus, Campylobacter showae, E. nodatum, P. intermedia, P. micros, P. nigrescens et Streptococcus constellatus. Les espèces bactériennes du « complexe orange » font le lien entre les colonisateurs primaires et les bactéries du « complexe rouge », constitué de P. gingivalis, T. forsythia et T. denticola. Ce dernier complexe, représentant les parodontopathogènes les plus importants, a été fortement associé aux lésions parodontales avancées.

S. m/Mi S. oralis S. sanguis Streptococcus sp. S.gordonii S. intermedium

* B. forsythus est maintenant connue sous le nom de T. forsythia.

Figure 5 : Diagramme présentant les complexes bactériens de Socransky (tiré de Socransky et Haffajee, 2002).

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1.1.2.3.3 Facteurs bactériens de virulence

Les bactéries parodontopathogènes se caractérisent par leur capacité à produire des facteurs de virulence. Ces facteurs permettent aux bactéries de coloniser l'espace sous-gingival, de résister aux mécanismes de défense de l'hôte et de détruire les tissus parodontaux. Les bactéries pathogènes pour le parodonte possèdent des structures (fimbriae, capsule) ou molécules de surface (adhésines) leur permettant de s'attacher aux diverses surfaces buccales et d'envahir les tissus et les cellules de l'hôte afin d'assurer la colonisation de l'espace parodontal. Par la suite, ces bactéries parodontopathogènes sécrètent des leucotoxines et des enzymes leur permettant d'échapper au système de défenses immunitaires de l'hôte. Enfin, ces bactéries créent un dommage tissulaire en envahissant les tissus de l'hôte par la libération d'enzymes lytiques (proteases) et de toxines (endotoxines, exotoxines) (Curtis et al, 2005). Enfin, les facteurs de virulence peuvent déclencher une réponse immunitaire aboutissant à la libération de cytokines et de la prostaglandine E2 (PGE2) qui, à leur tour, activent plusieurs mécanismes de la dégradation

tissulaire qui font appel à de nombreuses molécules, dont les métalloprotéinases matricielles (MMPs) (Birkedal-Hansen, 1993; Okada et Murakami, 1998; Offenbacher et Salvi, 1999; Madianos e t a l , 2005).

1.1.2.3.3.1 Lipopolysaccharide

Le lipopolysaccharide (LPS), également appelé endotoxine, est un composant majeur de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Il représente le principal antigène de surface à fort potentiel d'immuno-stimulation (Dixon et Darveau, 2005). Cette molécule complexe contient à la fois des lipides et des glucides. Le LPS est formé de trois parties : un lipide A, un polysaccharide central et une chaîne latérale O (ou antigène O). Le lipide A, enfoui dans la membrane externe, représente la partie proximale du LPS, le polysaccharide central, sa partie médiane, et la chaîne latérale O, sa partie distale (Darveau et Hancock, 1983). Les fortes activités toxiques et immuno-stimulatrices du LPS sont

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attribuées au lipide A (Hashimoto et a l , 2004). Le LPS joue un rôle important dans la pathogénèse des maladies parodontales. Il a été démontré que le LPS des bactéries parodontopathogènes stimule une forte production de cytokines et de MMPs par les cellules immunitaires et les cellules résidentes du parodonte (Kent et al, 1998; Shapira et al, 1998; Bodet et al, 2007a).

1.1.2.3.4 Réponse immunodestructrice de l'hôte

Bien que la persistance des bactéries parodontopathogènes dans les sites sous-gingivaux soit essentielle au déclenchement de la parodontite, la réponse immunodestructrice de l'hôte face à l'agression constante du système immunitaire par ces bactéries et leurs produits, module l'évolution de la maladie vers la destruction ou la guérison (Kornman et al, 1997; Kinane et Lappin, 2001; Schenkein, 2006). Au cours de la dernière décennie, de nombreuses éludes ont démontré le rôle important des différents médiateurs de l'inflammation dans l'homéostasie des tissus. Toutefois, une surproduction de ces médiateurs entraîne une inflammation chronique qui est à l'origine de la destruction tissulaire. Les cytokines qui ont été fortement associées à la progression de la parodontite sont lTL-lot, 1TL-18,1TL-6,1TL-8 et le TNF-a. Ces dernières jouent un rôle central dans la pathogénèse de la maladie parodontale puisqu'elles favorisent le processus inflammatoire et la résorption osseuse (Okada et Murakami, 1998). La PGE2> un médiateur de

l'inflammation, participe également à la résorption osseuse (Offenbacher et Salvi, 1999). Les cytokines et les médiateurs de l'inflammation peuvent ensuite activer un ou plusieurs facteurs de dégradation tissulaire, notamment les MMPs, (Reynolds et Meikle, 1997; Okada et Murakami, 1998; Sorsa et a l , 2004). Les MMPs sont impliquées dans la destruction du collagène et la résorption osseuse. Les MMPs qui ont été associées à la destruction parodontale sont la MMP-2, la MMP-3, la MMP-8 et la MMP-9 (Birkedal-Hansen et a l , 1993).

(30)

1.1.2.4 Epidemiologic

1.1.2.4.1 Prévalence et incidence

Les maladies parodontales comptent parmi les infections microbiennes les plus courantes chez l'adulte. La prévalence des problèmes parodontaux chez les adultes des pays industrialisés a fait l'objet de plusieurs études. L'Organisation mondiale de la santé (OMS) a compilé au-delà de 100 études mesurant l'Indice communautaire des besoins en traitements parodontaux (CPITN) pour évaluer l'atteinte parodontale chez les personnes âgées entre 35 et 44 ans. La plupart des adultes présentent du tartre et/ou un saignement gingival puis, en fonction du pays, entre 5 et 20% des sujets souffrent de maladies parodontales sévères (Miyazaki et a l , 1991). Aux États-Unis, Albandar et coll. (1999) ont examiné la prévalence de la maladie parodontale chez les personnes âgées de 30 à 90 ans. Ainsi, parmi les adultes dentés, au moins 35% sont atteints de parodontite. Au Canada, très peu d'études ont évalué la prévalence des problèmes parodontaux chez la population canadienne d'âge moyenne. Une étude réalisée en Saskatchewan auprès d'adultes âgés de

19 ans et plus a révélé que parmi les sujets âgés de 30 à 44 ans, 34% ont des poches parodontales de 4 ou 5 mm, et 15% en ont de 6 mm ou plus (Hoover et Tynan, 1986a; Hoover et Tynan, 1986b). Au Québec, Brodeur et coll. (2001) ont examiné la prévalence des problèmes parodontaux chez les adultes québécois âgés de 35 à 44 ans. Parmi les adultes qui ne sont pas complètement édentés, plus de 80% ont du tartre et/ou des saignements gingivaux, 50% ont au moins une dent présentant une poche parodontale de 4 à 5 mm et 20% ont une poche parodontale de 6 mm ou plus.

1.1.2.4.2 Facteurs de risque

Outre la quantité et la composition du biofilm dentaire, d'autres facteurs propres à l'hôte déterminent la vitesse de progression et la sévérité de la parodontite. Plusieurs travaux scientifiques ont permis d'identifier ces principaux facteurs de risque : l'âge (Horning et

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a l , 1990; Christersson et a l , 1992; Genco et Loe, 1993; Grossi et a l , 1995), le sexe (Christersson et al, 1992; Grossi et al, 1995; Calsina et a l , 2002), l'appartenance ethnique (Beck et a l , 1992; Christersson et al, 1992; Grossi et al, 1995), l'hérédité génétique (Michalowicz et al, 1991; Michalowicz, 1994), les maladies systémiques (Genco et Loe,

1993), les changements hormonaux chez la femme (Sooriyamoorfhy et Gower, 1989), les facteurs sociaux (Moss et al, 1996), certains médicaments (Rees et Levine, 1995), l'hygiène bucco-dentaire (Holm-Pedersen et al, 1975; Tervonen et a l , 1991) et le tabagisme (Bergstrôm, 1989; Haber et Kent, 1992; Horning et a l , 1992; Haber et al, 1993; Stoltenberg et a l , 1993; Bergstrôm et Preber, 1994; Haber, 1994; Grossi et al, 1994; Martinez-Canut et a l , 1995; Gelskey, 1999; Machtei et a l , 1999; Tanner et al, 2005).

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1.2 Tabagisme et maladies parodontales

1.2.1 Fumée de cigarette

Les conséquences de l'usage du tabac sur le parodonte ont fait l'objet d'un grand nombre d'études au cours des deux dernières décennies. Ces recherches ont confirmé le rôle de la fumée de cigarette en tant que facteur de risque principal pour le développement et la progression de la parodontite. Les fumeurs, même avec une bonne hygiène buccale, présentent souvent des maladies parodontales plus sévères que les non fumeurs (Bergstrôm, 1989). Ce risque augmente avec la durée de l'habitude du tabac et le nombre de cigarettes fumées quotidiennement. Selon le degré d'exposition, les fumeurs ont entre 2.5 et 7 fois plus de risque de présenter une parodontite que les non-fumeurs (Salvi et al, 1997). En effet, il a été estimé que le tabagisme est responsable de plus de la moitié des cas de parodontite chez l'adulte aux États-Unis (Tomar et Asma, 2000). Plus spécifiquement, 42% des cas de parodontite sont dus à un tabagisme actuel, alors que 11% des cas ont été mis en évidence chez des anciens fumeurs. De plus, un effet dose-dépendant a été constaté entre l'exposition à la fumée de cigarette et le risque de parodontite; les fumeurs ayant consommé plus de 10 cigarettes par jour présentent une progression plus importante de la maladie parodontale, comparativement aux non-fumeurs ou aux anciens fumeurs. Il est bien documenté dans la littérature que les fumeurs démontrent une perte osseuse et d'attache parodontale plus importante (Grossi et a l , 1995; Hyman et Reid, 2003), de même que des valeurs augmentées du sondage parodontal comparativement aux non-fumeurs (Linden et Mullally, 1994; Machuca et al, 2000; Van der Weijden et al, 2001; Calsina et al, 2002). De plus, les fumeurs démontrent une perte de dent prématurée en comparaison avec les non-fumeurs (Holm, 1994; Krall et al, 1997; Kerdvongbundit et Wikesjô, 2000). Enfin, les traitements parodontaux s'avèrent souvent moins efficaces chez les patients fumeurs (Ah et a l , 1994; Kaldahl et al, 1996a; Kaldahl et a l , 1996b; Preber et Bergstrôm,

1990; Tonetti et a l , 1995; Rosen et al, 1996; Bostrôm et a l , 1998a; Preber et Bergstrôm, 1986; Preber et a l , 1995; Grossi et al, 1997; Palmer et al, 1999).

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1.2.2 Pipe et cigare

Bien qu'à ce jour les conséquences délétères de la fumée de cigarette sur le parodonte sont les mieux documentées, les différentes formes de tabagisme peuvent également favoriser l'évolution de la maladie parodontale. Une étude d'Albandar et coll. (2000) a démontré que les fumeurs de pipe ou de cigares présentent un risque aussi élevé que celui des fumeurs de cigarettes en ce qui concerne la perte d'attache, la récession gingivale et la profondeur des poches parodontales.

1.2.3 Microflore sous-gingivale

Le tabac agit sur le parodonte mais également sur la microflore buccale. Les fumeurs présentent des variations quantitatives et qualitatives dans la composition de leur flore bactérienne sous-gingivale comparativement aux non-fumeurs. Bergstrôm et Preber (1986) ont démontré que les patients fumeurs ont une plus grande quantité de plaque dentaire que les non-fumeurs. Une augmentation de la prévalence et de la proportion des espèces bactériennes A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. forsythia, P. intermedia, P. micros, F. nucleatum, C. rectus, C. concisus et C. gracilis a également été rapportée chez les patients fumeurs par rapport aux non-fumeurs (Zambon et a l , 1996; Kamma et al, 1999; van Winkelhoff et a l , 2002).

1.2.4 Réponse immunodestuctrice de l'hôte

Le tabac altère les réactions de défense de l'hôte face à l'agression bactérienne. Les principaux effets du tabac sur le système de défense sont les suivants : la réponse inflammatoire est réduite (Bergstrôm et Preber, 1985; Bostrôm et al, 2000; Bergstrôm et Bostrôm, 2001; Dietrich et al, 2004), le nombre de PMN est augmenté (Barbour et al,

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1979; MacFarlane et al, 1992), et la synthèse d'anticorps sériques (IgG) est atténuée (Quinn et al, 1996; Barbour et al, 1997; Graswinckel et a l , 2004). La production de cytokines est également affectée par l'usage du tabac. Plus spécifiquement, les concentrations d'IL-8 (Giannopoulou et al, 2003) et de TNF-a (Bostrôm et al, 1998a; Bostrôm et al, 1998b; Bostrôm et al, 1999) dans le liquide créviculaire gingival sont augmentées chez les patients fumeurs alors que les concentrations d'IL-la (Petropoulos et a l , 2004) et IL-4 (Giannopoulou et a l , 2003) sont diminuées.

1.2.5 Nicotine

L'usage compulsif du tabac a été observé partout où il a été introduit. Malgré les connaissances dont disposent les fumeurs sur les nombreux risques pour la santé et les bienfaits associés à la cessation tabagique (Christen, 1992), la consommation de tabac demeure une habitude difficile à abandonner. La nicotine, l'une des composantes majeures du tabac, est un alcaloïde naturellement retrouvé dans de nombreuses plantes qui entraîne la dépendance chez l'utilisateur (Stolerman et Jarvis, 1995). Parmi les 4 000 substances qui se dégagent de la combustion du tabac (Green et Rodgman, 1996), la quantité de nicotine se situe entre 0.5 et 1.6 mg par cigarette (Calafat et al, 2004). Les muqueuses buccales constituent une importante cible pour les nombreux constituants de la fumée du tabac. En effet, Cuff et coll. (1989) ont rapporté que la nicotine, excrétée dans le liquide créviculaire gingival, s'accumule au niveau de la surface radiculaire. Il a été rapporté que la nicotine réduit in vitro la capacité d'adhésion des fibroblastes sur la surface radiculaire (Raulin et a l , 1988; James et al, 1999; Giannopoulou et al, 1999; Tanur et a l , 2000), ce qui rend moins favorable la guérison des plaies à la suite des traitements parodontaux chez les patients fumeurs (Heasman et al, 2006). La nicotine, ayant une demi-vie d'environ 2 heures, montre une concentration moyenne sanguine de 33 ng/ml (Russell et al, 1980) tandis que sa concentration dans la salive peut atteindre jusqu'à 1.56 mg/ml (Hoffmann et Adams, 1981), soit environ 50 000 fois celle retrouvée dans le sang. La nicotine pourrait donc largement contribuer au développement d'atteintes parodontales.

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1.2.6 Mécanismes oxydatifs

L'oxygène (02) est une molécule indispensable à la vie. Cependant, en raison de sa

structure chimique, l'02 peut s'avérer toxique. Cette toxicité est révélée par les radicaux

libres oxygénés (ROS), communément appelés radicaux libres. Ces espèces sont produites continuellement par le corps via le métabolisme cellulaire normal de l'oxygène. Ce sont des molécules possédant un électron non apparié dans l'orbitale électronique la plus externe. Ceci confère une grande instabilité aux molécules qui deviennent réactives et qui cherchent à atteindre un état de stabilité en s'appropriant un électron d'une autre molécule (Willcox et a l , 2004). Plusieurs facteurs peuvent mener à l'augmentation de la production endogène de radicaux libres notamment les maladies chroniques telles les maladies parodontales, de même qu'une panoplie de facteurs environnementaux comme la fumée de cigarette. Cette prédominance des mécanismes oxydatifs correspond à un état dit de « stress oxydatif ». Ce stress oxydant a donc des effets délétères potentiels sur le parodonte.

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1.3 Polyphenols

1.3.1 Définition

La pratique régulière d'activité physique et l'adoption d'une alimentation équilibrée et riche en fruits et légumes sont au cœur des recommandations émises par les professionnels de la santé pour prévenir et traiter plusieurs pathologies. Parmi les éléments majeurs contribuant à fournir à notre alimentation des propriétés fonctionnelles, les polyphenols occupent une place de choix. Les polyphenols constituent une famille de molécules organiques largement présentes dans le règne végétal. Pour la plupart, il s'agit de composés donnant la couleur et le goût particulier aux fruits et légumes. Ils sont caractérisés par la présence de plusieurs groupements phénoliques souvent associés en structures complexes de haut poids moléculaire. Les polyphenols sont présents dans de nombreux aliments notamment dans les fruits et les breuvages dont le thé et le vin. Les fruits tels les pommes, les raisins, les poires, les cerises et les baies peuvent contenir de 200 à 300 mg de polyphenols par 100 g de poids frais. De façon générale, un verre de vin rouge ou une tasse de thé contient environ 100 mg de polyphenols. Les céréales, le chocolat ainsi que les légumineuses sèches contribuent également d'une façon significative à l'apport en polyphenols (Scalbert et al, 2005).

1.3.2 Classification

Des milliers de polyphenols différents ont été identifiés dans le règne végétal (Scalbert et Williamson, 2000; Scalbert et al, 2005). Les deux familles principales de polyphenols sont les flavonoïdes et les acides phénoliques. À l'heure actuelle, on distingue près de 4 000 flavonoïdes, ces derniers étant regroupés en plusieurs classes en fonction de leur structure moléculaire (figure 6) (Nijveldt et a l , 2001). Les quatre classes principales des flavonoïdes, soit les flavones, les flavanones, les catéchines et les anthocyanines, de même que leurs sous-classes et leurs sources alimentaires sont énumérées dans le tableau 2.

(37)

Flavone

OH

Catechine Anthocyanine

Figure 6 : Structure moléculaire des classes principales des flavonoïdes (tirée et adaptée de Nijveldt e t a l , 2001).

(38)

Tableau 2 : Classification des principaux flavonoïdes (tirée et adapté de Nijveldt et al, 2001).

Classes Sous-classes Sources alimentaires

Flavones Apigénine Pelures de pomme

Chrysine Baies

Kaempférol Brocoli

Lutoléine Céleri

Myricétine Pelures de fruit

Rutine Canneberges

Sibélia Raisins

Quercétine Laitue

Olives

Flavanones Fisétine Agrumes

Hespéridine Pelure d'agrume Narigine

Naringénine Taxifoline

Catéchines Catéchine Vin rouge

Épicathéchine Thé

Épigallocatéchine gallate

Anthocyanines Cyanidine Baies

Delphinidine Cerises

Malvidine Raisins

Pélargonidine Framboises

Péonidine Raisins rouge

Pétunidine Vin rouge

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Depuis une dizaine d'années, l'intérêt pour la recherche sur les polyphenols s'est amplifié, notamment grâce à leurs potentiels effets bénéfiques pour la santé humaine. En effet, leur rôle d'antioxydants naturels suscite de plus en plus d'intérêt pour la prévention et le traitement de plusieurs maladies (Scalbert et al, 2005).

1.3.1 Mécanismes antioxydatifs

L'importance accordée aux propriétés antioxydantes des polyphenols résulte du fait que ces derniers seraient capable de neutraliser et réduire les dommages causés par les radicaux libres dans l'organisme (Nijveldt et al, 2001). Une des caractéristiques communes à la plupart des antioxydants exogènes est la présence de liaisons doubles dans leur structure moléculaire. Ces liens doubles permettent donc à un électron libre provenant d'un radical libre d'être capté. Les groupements phénoliques des polyphenols peuvent ainsi accepter un électron et former des radicaux phénoxyl relativement stables (Scalbert et a l , 2005). Par ailleurs, au-delà de leur capacité à neutraliser les radicaux libres, les antioxydants possèdent également de nombreuses autres propriétés pouvant être bénéfiques pour la santé. Parmi ces propriétés, notons leurs activités inflammatoires, allergiques, anti-microbiennes et anti-cancéreuses (Middleton, 1998). Les spécialistes de la santé suggèrent qu'une alimentation riche en antioxydants pourrait ainsi prévenir le stress oxydatif et de nombreuses maladies dégénératives et chroniques (Willcox et al, 2004).

1.3.2 Flavonoïdes et maladies parodontales

Au cours de la dernière décennie, l'intérêt de la communauté scientifique pour l'étude des polyphenols s'est amplifié, notamment à cause de leurs effets protecteurs contre de nombreuses maladies chroniques. Plus spécifiquement, des études récentes suggèrent que les nombreuses propriétés des polyphenols s'avèrent prometteuses pour la prévention et le

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(NDM) de haut poids moléculaire préparé à partir d'un concentré de jus de canneberges, soumis à la dialyse et libéré des molécules organiques de faible poids moléculaire dont les sucres et les acides, a un effet anti-adhésif empêchant les bactéries parodontopathogènes d'adhérer les unes aux autres pour former le biofilm dentaire (Labrecque et a l , 2006). Le NDM a aussi démontré une forte activité anti-inflammatoire, en réduisant la sécrétion de médiateurs inflammatoires (Bodet et al, 2007b), et anti-destruction tissulaire, en réduisant la production de MMPs par les cellules de l'hôte (Bodet et al, 2007c). Les proanthocyanidines (PACs) de type A, également isolées de la canneberge, ont démontré une capacité à réduire les propriétés virulentes de P. gingivalis, la production de chimiokines par les cellules épithéliales (La et al, 2010), de même que la sécrétion de MMPs par les macrophages (La et al, 2009). Il a également été rapporté que la naringénine, un polyphenol retrouvé principalement dans les agrumes, ainsi qu'un extrait de réglisse (Glycyrrhiza uralensis) ont des propriétés anti-inflammatoires en inhibant la production de médiateurs inflammatoires par les cellules de l'hôte, suite à une stimulation par les LPS de bactéries parodontopathogènes (Bodet et al, 2008a; Bodet et al, 2008b). Récemment, il a été démontré que la consommation régulière de thé vert exerce un effet bénéfique sur la santé du parodonte, notamment au niveau du contrôle de la profondeur des poches parodontales, de la perte d'attache clinique et du saignement gingival lors du sondage (Kushiyama et al, 2009). Enfin, une étude utilisant un extrait de pépins de raisins rouges a montré une réduction de la production d'oxyde nitrique (NO) et de ROS ainsi que de l'expression de l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) par les cellules de l'hôte suite à une stimulation par le LPS de bactéries parodontopathogènes (Houde et al, 2006). L'ajout éventuel de polyphenols dans des produits d'hygiène buccale représente donc un moyen prometteur pour la prévention et le traitement des maladies parodontales.

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1.4 Problématique

1.4.1 Hypothèse de recherche

Certains polyphenols dérivés de plantes ou de petits fruits contribuent à réduire les problèmes parodontaux liés au tabagisme en inhibant les effets toxiques et inflammatoires induits par la nicotine vis-à-vis les cellules épithéliales et les fibroblastes d'origine buccale.

1.4.2 Objectifs de la recherche

I. Évaluer les effets toxiques de la nicotine, seule et en combinaison avec le lipopolysaccaride de bactéries parodontopathogènes (A. actinomycetemcomitans et P. gingivalis) vis-à-vis les cellules épithéliales et les fibroblastes d'origine buccale. II. Évaluer la capacité de polyphenols dérivés de plantes et de petits fruits à neutraliser les

effets cytotoxiques de la nicotine.

III. Évaluer la capacité de polyphenols dérivés de plantes et de petits fruits à neutraliser les effets inflammatoires de la nicotine.

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2 Matériel et méthodes

2.1 Culture bactérienne et préparation du

lipopolysaccharide

A. actinomycetemcomitans American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, États-Unis) 29522 (serotype b) et P. gingivalis ATCC 33277 ont été cultivées dans un milieu Todd-Hewitt (THB; BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada) enrichi avec 1% d'extrait de levure, 0.001% d'hémine et 0.0001% de vitamine K. Les cultures bactériennes ont été incubées à 37°C en anaérobiose (80% N2, 10% H2, 10% C02) pendant 24 heures.

Les LPS ont été isolés à partir des cellules d'A. actinomycetemcomitans et de P. gingivalis selon la procédure décrite par Darveau et Hancock (1983). La méthode de purification du LPS est basée sur la digestion des protéines cellulaires par la proteinase K et la digestion des acides nucléiques par la désoxyribonucléase (DNase) et la ribonuclease (RNase). Les préparations de LPS ont été lyophilisées et conservées à -20°C. La présence d'une contamination protéique dans les préparations de LPS a été évaluée à l'aide d'un essai colorimétrique (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canada) utilisant de l'albumine sérique de bœuf comme contrôle, et s'est avérée être inférieure à 0.001%.

2.2 Produits chimiques

La nicotine (3-[l-méthyl-2-pyrrolidyl] pyridine), l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG), la myricétine et la quercétine ont été achetées chez Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, États-Unis). Les extraits bruts de canneberges (CT1 et CT2), de pépins de raisins rouges, de réglisse et de cassis, de même que les polyphenols ultra pures dont la licoricidine, la licorisolflavane A, la cyanidine-3-glucoside, la cyanidine-3-rutinoside et la delphinidine-3-rutinoside ont été fournis par la compagnie Tom's of Maine (Kennebunk, ME, États-Unis). Les PACs de type A, isolées de la canneberge, ont été gracieusement fournies par Dre Amy

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Howell (Rutgers, The State University of New Jersey, Chatsworth, NJ, États-Unis). Le NDM de haut poids moléculaire de la canneberge a été préparé dans le laboratoire de Dr Daniel Grenier (Université Laval, Québec, QC, Canada) à partir d'un concentré de jus de canneberges (Ocean Spray, Lakeville-Middleboro, MA, États-Unis). Pour toutes les expériences, les solutions concentrées ont été préparées dans de l'éthanol 95%, à l'exception de la cyanidine-3-glucoside, la cyanidine-3-rutinoside, la delphinidine-3-rutinoside et du NDM qui ont été préparés dans de l'eau stérile. Les solutions ont été conservées à 4°C protégées de la lumière.

2.3 Conditions de culture des cellules épithéliales et des

fibroblastes d'origine buccale

Les cellules épithéliales buccales humaines GMSM-K ont été gracieusement fournies par Dre Valérie Murrah (University of North Carolina, Chapel Hill, NC, États-Unis), alors que les fibroblastes gingivaux humains primaires HGF-1 ont été achetés de l'ATCC. La lignée de cellules épithéliales buccales GMSM-K immortalisées possède un phénotype epithelial basé sur des analyses immunohistochimiques (Gilchrist et a l , 2000). Les deux lignées cellulaires ont été cultivées jusqu'à confluence dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 4 mM L-glutamine (HyClone Laboratories, Logan, UT, États-Unis), 10% de sérum de veau fœtal inactivé à la chaleur (FBS; Sigma-Aldrich Corp.) et 100 pg/ml de pénicilline G-streptomycine à 37°C en présence de 5% de C02 dans des

flacons de culture cellulaire T-175 (Sarstedt, Newton, NC, États-Unis). Les cellules ont été récoltées par trypsinisation (2 minutes à 37°C) avec une solution 0.05% de trypsine-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA; Invitrogen, Grand Island, NY, États-Unis). Les cellules ont par la suite été comptées à l'aide d'un hémacytomètre et suspendues dans le milieu de culture aux concentrations requises.

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2.4 Traitement des cellules épithéliales et des fibroblastes et

détermination de la viabilité cellulaire

Les cellules épithéliales ont été ensemencées (100 pl) à une concentration de 4 x 105

cellules/ml et les fibroblastes à une concentration de 1 x IO5 cellules/ml dans des

microplaques de 96 puits (Sarstedt). Les cellules ont été cultivées pendant 18 heures dans le milieu de culture DMEM contenant 4 mM L-glutamine, 10% de FBS inactivé à la chaleur et 100 pg/ml de pénicilline G-streptomycine à 37°C en présence de 5% de C02.

Les cellules épithéliales et les fibroblastes à confluence ont été traités avec des concentrations croissantes (finales) de LPS (0, 2, 5, 10, 20 pg/ml) et/ou de nicotine (0, 25, 50, 75, 100, 125, 150 pg/ml) pendant 24 heures à 37°C en présence de 5% de C02 avant de

déterminer la viabilité cellulaire. Afin d'évaluer l'effet cytoprotecteur des polyphenols à l'étude, les cellules ont été prétraitées pendant 2 heures avec des concentrations non-toxiques (préalablement déterminées) de ces flavonoïdes puis mises en présence de nicotine pendant 24 heures. Des cellules non stimulées ainsi qu'un contrôle négatif (éthanol 95% pour la nicotine et tampon phosphate salin [PBS] stérile pour le LPS) ont été inclus dans toutes les expériences.

La viabilité des cellules épithéliales et des fibroblastes a été déterminée à l'aide de l'essai colorimétrique utilisant le bromure de 3-[4, diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium (MTT; Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne), selon le protocole du manufacturier. Ce test est basé sur la transformation des sels de tétrazolium en cristaux de formazan par la succinate déshydrogénase, une enzyme mitochondriale. Les cristaux de formazan formés sont par la suite solubilisés et mesurés par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 550 nm. Les expériences ont été réalisées en quadruple et répétées pour un minimum de trois fois.

(45)

2.5 Traitement des cellules épithéliales et dosage des

cytokines sécrétées

Les cellules épithéliales ont été ensemencées (500 pl) à une concentration de 4 x 105

cellules/ml dans des microplaques de 24 puits (Sarstedt). Elles ont été cultivées pendant 18 heures dans le milieu de culture DMEM contenant 4 mM L-glutamine, 10% de FBS inactivé à la chaleur et 100 pg/ml de pénicilline G-streptomycine à 37°C en présence de 5% de C02. Par la suite, le milieu de culture a été remplacé par du milieu frais et les cellules

épithéliales à confluence ont été traitées avec des concentrations croissantes (finales) d'extrait brut de cassis (0, 5, 25, 50 pg/ml), de cyanidine-3-glucoside (0, 5, 25, 50 pg/ml), ou d'EGCG (0, 5, 10 pg/ml) puis incubées à 37°C en présence de 5% de C02 pendant

2 heures avant d'être stimulées avec de la nicotine à des concentrations finales de 12.5, 25, 50 et 75 pg/ml. Après 24 heures d'incubation (37°C/5% de C02), le surnageant des milieux

de culture a été prélevé et conservé à -20°C.

Des trousses commerciales d'Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA; R&D Systems, Minneapolis, MN, États-Unis) de type sandwich ont été utilisées selon le protocole du manufacturier pour doser la cytokine pro-inflammatoire IL-6, ainsi que les chimiokines IL-8 et (C-C motif) ligand 5 (CCL5), auparavant appelée Regulated on Activation Normal T cell Exposed and Secreted (RANTES). Les protéines recombinantes fournies dans les trousses ont servi pour l'établissement des courbes standards. L'absorbance à une longueur d'onde de 450 nm a été mesurée en utilisant un lecteur de microplaque (Modèle 680, Bio Rad Laboratories). La sensibilité du test ELISA était de 9.3 pg/ml pour IL-6, 31.2 pg/ml pour IL-8 et 15.6 pg/ml pour CCL5. Les concentrations de cytokines ont été déterminées en triplicata.

Figure

Figure 1 : Représentation schématique de la dent et du parodonte sain (tirée et adaptée de
Figure 2 : Représentation schématique d'une coupe histologique décrivant la composition  de la gencive et la zone de contact entre la gencive et l'émail (tirée et adaptée de Lindhe et  al, 2003)
Figure 3 : Modèle actuellement accepté de la maladie parodontale (tiré de Mattout et  Mattout, 2003)
Tableau 1 : Classification des maladies parodontales révisée en 1999 par l'Académie  Américaine de Parodontologie (APP) (tiré et adapté de Wiebe et Putnins, 2000)
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