La différenciation des cellules ES DctLago1-Néo/+ et DctH2BmCherry-Néo/+ en mélanocytes a permis d’obtenir des cellules pigmentées. J’ai observé des cellules Dct-LacZ qui étaient pigmentées et X-gal-positives. En revanche, je n’ai pas observé de cellules DctLago1-Néo/+ qui étaient pigmentées et positives. En outre, les premières cellules Dct-LacZ X-gal-positives sont apparues bien avant que la mélanine ne soit visible (à J12). Au contraire, les premières cellules DctLago1-Néo/+ X-gal positives n’ont été remarquées qu’après l’apparition des grains de mélanine (à J25). Cette observation a été faite sur deux expériences successives. Enfin, de nombreuses cellules X-gal-positives, DctLago1-Néo/+ ou Dct-LacZ, ne sont pas pigmentées. Ces cellules X-gal-positives sont vraisemblablement des mélanoblastes, puisque elles sont situées à proximité de cellules pigmentées. Pour confirmer cette hypothèse, il faudrait effectuer une immunofluorescence avec un anticorps contre une protéine exprimée dans les mélanoblastes, comme par exemple un anticorps anti-DCT ou anti-MITF.
L’apparition tardive des cellules X-gal-positives dans les cellules DctLago1-Néo/+ pourrait être due à une très faible activité du promoteur du gène Dct. L’activité β-galactosidase n’est détectée que lorsque la quantité de protéines présentes dans le noyau atteint une valeur seuil. Cela pourrait expliquer le faible marquage X-gal observé, de couleur bleu pâle. L’absence de coloration bleue dans les cellules pigmentées pourrait s’expliquer aussi par un niveau d’expression de la β-galactosidase très faible. Le marquage pourrait être masqué par les pigments. Cependant, la coloration bleue devrait alors être visible dans des cellules pigmentées qui contiennent peu de mélanine.
Nous avons noté que l’expression du gène rapporteur mCherry n’est pas détectée dans des cellules DctH2BmCherry-Néo/+ en microscopie à fluorescence. Un anticorps anti-mCherry a cependant révélé que la protéine mCherry est exprimée dans les cultures de cellules ES se
155 différenciant en mélanocytes. La protéine mCherry a été observée dans des cellules non pigmentées et pigmentées. Il semble que la quantité de protéine mCherry soit trop faible pour que sa fluorescence directe soit visible. En comparaison, la méthode de coloration par le X-gal est très sensible. Il serait néanmoins intéressant d’utiliser un anticorps anti-β-galactosidase sur des cellules DctLago1-Néo/+ pour rechercher la présence de la protéine plutôt que son activité. Nous avons combiné des expériences qui utilisent des anticorps anti-β-galactosidase et anti-DCT sur des cultures des cellules ES DctLago1-Néo/+, sans succès. Une mise au point des conditions expérimentales de cette double immunofluorescence permettrait d’évaluer la quantité de β-galactosidase dans les mélanoblastes/cytes se différenciant à partir des cellules ES DctLago1-Néo/+.
Le profil d’expression du gène Lago1 chez les souris DctLago1/+ nous amène également à nous demander si le promoteur Dct n’est pas trop faible pour exprimer un gène rapporteur. Contrairement aux embryons Dct-LacZ colorés in toto qui présentent un marquage bleu très fort, le seul marquage X-gal observé chez les embryons DctLago1/+ colorés in toto est localisé dans le RPE. Si le marquage X-gal chez les embryons DctLago1/+ est aussi faible que celui qui est observé dans les cellules ES en différenciation de même génotype, il est possible que le marquage X-gal ne soit pas visible sur l’embryon in toto, parce que trop faible. Pour préciser le profil d’expression du gène Lago1, il serait utile d’éclaircir les embryons DctLago1/+ au glycérol, ce qui rendrait les tissus « translucides ». Nous pourrions peut-être ainsi déterminer s’il s’agit d’un problème d’intensité du marquage.
Nous avons réalisé des coupes de peau de souris adultes Dct-LacZ et DctLago1/+ puis nous les avons post-colorées. Les follicules pileux de souris adultes sont très pigmentés. Malgré la pigmentation intense dans le bulbe, l’activité β-galactosidase est très forte dans les follicules pileux des souris Dct-LacZ. Chez les souris DctLago1/+, le marquage X-gal n’est pas visible. Il est peut-être masqué par la pigmentation. Là encore, il semble que l’expression du gène Lago1, sous le contrôle du promoteur Dct, soit trop faible pour être détectée. La peau de l’oreille est beaucoup plus fine et la pigmentation y est moins intense. Nous avons observé un marquage X-gal au niveau de la peau de l’oreille, sans que nous ayons pu identifier le type cellulaire marqué. Une immunofluorescence avec un anticorps anti-DCT sur des coupes d’oreille, pourrait permettre de savoir si des mélanoblastes/cytes sont marqués. Pour contourner le problème de l’intense pigmentation des bulbes dans les follicules pileux, nous pourrions analyser le profil d’expression de l’allèle DctLago1 dans un fond génétique albinos
156 Figure 49 : Comparaison des constructions des souris knock in DctLago1/+, DctCre/+ et de la souris
transgénique Dct-LacZ
De haut en bas sont représentées l’allèle Dct endogène, l’allèle DctLago1/+, le transgène Dct-LacZ, de nouveau l’allèle DctLago1/+ et l’allèle DctCre/+. A gauche sont représentés les photos d’embryons de stade E11,5 colorés en X-gal en fonction de la construction associée. Pour l’allèle endogène, il s’agit de la photo de l’hybridation in situ. Les rectangles bleus figurent les exons du gène Dct. Les séquences absentes dans l’allèle DctLago1/+ sont indiquées en bleu. La séquence de 300 pb supplémentaire chez le knock in DctLago1/+ par rapport au knock in DctCre/+ est indiquée en violet.
157 (Tyrc/c). Nous pourrions établir le rôle de la pigmentation dans notre difficulté à visualiser le marquage X-gal.
3.2 La construction utilisée est-elle responsable de la faible expression des