La souris transgénique Dct-Cre et la souris knock in Dcttm1(Cre)Bee/+ (appelée DctCre/+ dans ce manuscrit) ont été décrites en 2002 (Guyonneau, et al., 2002). Ce sont les premières souris qui expriment la Cre recombinase dans les mélanocytes. Le profil d’expression de la Cre chez ces souris a été étudié par croisement avec des souris des lignées Rosa26tm1Sor (R26R) et Z/EG. La lignée R26R possède un rapporteur LacZ interrompu par une cassette Stop encadrée de sites loxP. Dans les cellules où la Cre recombinase est exprimée, la cassette Stop est perdue et le rapporteur LacZ est traduit. La lignée R26R exprime donc le rapporteur LacZ sous condition d’expression de la Cre. Les souris Z/EG possèdent un gène LacZ encadré de sites loxP ; lorsque la Cre recombinase est active, le gène LacZ est perdu ce qui permet l’expression d’une protéine GFP. Les embryons hybrides Dct-Cre × R26R présentent les mêmes marquages par coloration X-gal que ceux observés chez les embryons Dct-LacZ. A E12,5, le marquage est présent dans le RPE, les mélanoblastes en migration et le télencéphale (Guyonneau, et al., 2002). Comme pour les embryons Dct-LacZ, une expression du transgène LacZ est observée au niveau des ganglions et des nerfs rachidiens. Cette expression est alors considérée comme ectopique. Les embryons hybrides Dct-Cre × Z/EG ont également été étudiés. Des cellules fluorescentes sont détectées dans le RPE et dans le télencéphale à partir de E10,5. A E12,5, des cellules fluorescentes sont visibles dans la région latérale du tube neural, principalement dans le tronc. Ces cellules correspondent aux mélanoblastes en migration (Guyonneau, et al., 2002). De façon surprenante, aucun marquage GFP n’est détecté dans les ganglions et les nerfs rachidiens (Guyonneau, et al., 2002).
Le gène Cre a été intégré à la place du premier exon du gène Dct par recombinaison homologue dans des cellules ES. Des souris chimères ont été obtenues après injection des cellules ES recombinées homologues dans des blastocystes. Enfin, suite au croisement des souris chimères avec des femelles C57BL/6J, des souris knock in DctCre/+ ont été engendrées. Le profil d’expression de la Cre chez les souris knock in DctCre/+ a été étudié (Guyonneau, et al., 2002). Les souris knock in ont été croisées avec les souris R26R. Chez les embryons et les
103 adultes hybrides DctCre/+ × R26R une expression du rapporteur LacZ a été détectée dans les mélanoblastes et les mélanocytes. Cependant cette expression a été observée plus tardivement (à E12,5) que chez les souris Dct-LacZ et Dct-Cre × R26R, où elle est observée dès E10,5 (Guyonneau, et al., 2002). A E12,5, la coloration X-gal n’est pas identique chez les souris DctCre/+ × R26R et chez les transgéniques Dct-LacZ (Figure 36). Bien que la coloration bleue permette de visualiser les mélanoblastes/cytes chez les embryons DctCre/+ × R26R, quelques follicules pileux seulement sont colorés en bleu chez les adultes DctCre/+ × R26R (Guyonneau, et al., 2002). Ces résultats inattendus ne sont pas discutés dans l’article de Guyonneau et collaborateurs.
Figure 36 : Comparaison du profil d'expression de LacZ (Guyonneau, et al., 2002) et (Mackenzie, et al., 1997)
A- Expression du gène rapporteur LacZ au stade E12,5 chez les souris DctCre/+ × R26R.
B- Expression du gène rapporteur LacZ chez les souris transgéniques Dct-LacZ au même stade.
Les souris knock in DctCre/+ ont été croisées entre elles pour donner naissance à des souris homozygotes DctCre/Cre (Guyonneau, et al., 2004). Ces souris n’expriment pas l’ARNm Dct ni la protéine DCT (Guyonneau, et al., 2004). Les souris homozygotes DctCre/Cre ont un pelage d’une couleur plus claire et diluée que les souris DctCre/+ et de génotype sauvage. Ce phénotype est observé sur fonds agouti et nonagouti. Les organes dans lesquels Dct est normalement exprimé ont été analysés : le cerveau, les yeux et la peau. Aucune différence significative n’a été détectée entre les organes de souris DctCre/Cre et sauvages. D’autres organes qui n’expriment pas Dct sont normaux. Les conséquences phénotypiques dues à une
105 absence d’expression de DCT sont restreintes aux mélanocytes, avec un effet décrit sur la couleur du pelage uniquement (Guyonneau, et al., 2004). Des cultures primaires de mélanocytes ont pu être dérivées de souris homozygotes DctCre/Cre. L’absence d’expression de DCT ne semble affecter ni la viabilité, ni la prolifération de mélanocytes in vitro (Guyonneau, et al., 2004).
D’après Jiao et collaborateurs, la protéine DCT joue un rôle dans la prolifération des progéniteurs neuronaux (Jiao, et al., 2006). La souris DctCre/Cre ne présente cependant aucun défaut dans le cerveau ou dans le système nerveux périphérique. Ces résultats sont en contradiction avec l’hypothèse d’un rôle de Dct dans les progéniteurs neuronaux. De nombreux facteurs de croissance régulent la prolifération des progéniteurs neuronaux, comme le bFGF (basic fibroblast growth factor) et l’EGF (epidermal growth factor) (Cairns and Finklestein, 2003; Deleyrolle, et al., 2006; Wang, et al., 2004). D’autres facteurs de croissance peuvent donc compenser l’absence de Dct pendant le développement embryonnaire (Jiao, et al., 2006).
Les souris DctCre/Cre ont été comparées aux souris portant la mutation slaty (Dctsl). Les phénotypes de couleur du pelage sont très similaires. Les doubles hétérozygotes DctCre/sl issus du croisement entre les lignées DctCre/Cre et Dctsl/sl ne peuvent être distinguée des homozygotes DctCre/Cre et Dctsl/sl (Guyonneau, et al., 2004). Ce test de complémentation démontre que les deux mutations affectent le même gène et ont des effets similaires sur la synthèse d’eumélanine. Les follicules pileux DctCre/Cre et Dctsl/sl ont une quantité de mélanine significativement plus faible que les souris de génotype sauvage. Cependant, la quantité relative de mélanines chez les souris Dctsl/sl est significativement plus faible que chez les souris DctCre/Cre sans que cela soit visible au niveau du pelage (Guyonneau, et al., 2004). Les souris Dctsl/sl produisent une protéine DCT mutée. Aucune culture primaire de mélanocytes n’a pu être dérivée de souris Dctsl/sl.