Prolifération & Mort cellulaire

Au cours du développement, la signalisation Hedgehog joue couramment un rôle mitogène en plus de son rôle morphogène. La voie Notch est également connue pour activer la prolifération des progéniteurs de nombreuses lignées cellulaires. La signalisation Fgf3 est quant à elle reconnue pour son rôle dans la régulation de l’apoptose au cours de la formation de l’AH chez le poisson zèbre. Nous avons vu que l’inhibition de la voie NMD induit une dérégulation majeure des voies de signalisation contrôlant le développement de l’AH. L’une des conséquences est que l’AH présente un nombre accru de cellules, et ce dès 48 hpf. Pour essayer de déterminer si cette augmentation cellulaire est causée par un taux de prolifération supérieur ou à une mort cellulaire réduite, nous avons donc effectué des tests de prolifération et de mort cellulaire.

Une méthode de détection des cellules en prolifération est le marquage de la phosphorylation de l’histone 3 par des kinases de la famille Aurora/AIK, qui est un évènement crucial de la mitose cellulaire. L’immunohistochimie utilisant l’anticorps anti phospho-histone 3 (pH3) permet donc de marquer les cellules en mitose dans tout l’embryon (254). Une autre façon d’évaluer la prolifération cellulaire est de marquer l’ADN nouvellement synthétisé au cours d’une période de temps déterminée. En incubant les embryons avec l’analogue de thymidine EdU (5-éthynyl-2’- désoxyuridine), les cellules qui répliquent leur ADN au cours de la phase S, avant la mitose, vont incorporer cet analogue. Grâce à un réactif fluorescent nous pourrons ensuite marquer les cellules en prolifération au cours de l’incubation avec l’EdU.

Figure II.20: Prolifération cellulaire entre 50 et 72 hpf

Prolifération cellulaire entre 50 hpf et 72 hpf marquée par immunohistochimie après incorporation d’EDU. Embryons injectés avec 4 ng de morpholino contrôle (A et C) ou 4 ng de morpholino (1) ciblant dhx34 (B et D). Afin d’avoir une vue globale, chaque embryon est représenté par une photographie de sa tête et de son tronc. Les embryons sont présentés en position latérale, partie rostrale orientée à gauche.

Barre d’échelle= 100 µm

Figure II.21: Mort Cellulaire à 72 hpf

Mort cellulaire marquée à 72 hpf par la coloration à l’acridine orange. Embryons injectés avec 4 ng de morpholino contrôle (A et C) ou 4 ng de morpholino (1) ciblant dhx34 (B et D). Afin d’avoir une vue globale, chaque embryon est représenté par une photographie de sa tête et de son tronc. Les embryons sont présentés en position latérale, partie rostrale orientée à gauche. m: mâchoire; région otique.

Barre d’échelle= 100 µm

Figure II.19: Prolifération cellulaire entre 28 et 48 hpf

Prolifération cellulaire à 28 hpf (A-D), 36 hpf (E- H) et 48 hpf (I-L) marquée par immunohistochimie de l’histone 3 phosphorylé. Embryons injectés avec 4 ng de morpholino contrôle (A, C, E, G, I et K) ou 4 ng de morpholino (1) ciblant dhx34 (B, D, F, H, J et L). Afin d’avoir une vue globale, chaque embryon est représenté par une photographie de sa tête et de son tronc. Les embryons sont présentés en position latérale, partie rostrale orientée à gauche. Barre d’échelle= 100 µm

m ot

Résultats

55 L’absence d’anticorps en immunohistochimie ou de lignée transgénique spécifique à l’AH, ne nous permet malheureusement pas d’analyser la prolifération ni la mort cellulaire spécifiquement dans l’AH. A défaut, nous nous contentons donc d’une analyse globale.

Sur la [Figure II.19] nous pouvons voir que chez les morphants, la prolifération cellulaire à 28 et 48 hpf est similaire aux contrôles, alors qu’à 36 hpf elle semble être augmentée, et ce de manière générale dans la tête de l’embryon. Ceci est particulièrement intéressant puisque cette accentuation du taux prolifératif suit de près l’augmentation de la signalisation Hh.

Nous avons également constaté qu’entre 48 et 72 hpf, le nombre de cellules endocrines adénohypophysaire augmente largement. Afin d’essayer d’évaluer si cela résulte d’une augmentation de la différenciation ou un taux de prolifération supérieur à des stades plus tardifs, nous avons réalisé une incorporation d’EdU entre 50 et 72 hpf, et observé le résultat à 72 hpf [Figure II.20]. En vue latérale on constate que la prolifération globale est amoindrie chez les morphants par rapport aux embryons contrôle. Ces données nous permettent donc de penser que l’augmentation du nombre de cellules endocrines constatée à 72 hpf, correspond à un taux prolifératif des progéniteurs de l’AH supérieur à 36hpf ainsi qu’à la différenciation de ces cellules lors des étapes ultérieures.

Nous avons également testé l’apoptose induite par la diminution d’expression de

dhx34 et nbas via coloration in vivo à l’acridine orange. Le principe de cette méthode

repose sur le fait que l’acridine orange est capable de s’intercaler dans les cassures de l’ADN génomique des cellules en mort cellulaire (255, 256). En conséquence les cellules apoptotiques vont absorber le fluorophore au contraire des cellules vivantes. Nous pouvons voir sur la [Figure II.21] qu’à 3 dpf, les morphants présentent une augmentation de l’apoptose au niveau de la mâchoire ainsi que dans la région otique. En dehors de ces zones, l’injection des morpholinos dhx34 ou nbas ne semble pas induire de mort cellulaire.

di te rev teo ep ce pr

Figure II.22: Cerveau

Formation du cerveau observée à 48 hpf et révélée par hybridation in situ visible marquant les ARNms de neurod1 (A et B), de ascl1a (C et D), de nkx2.2a (E et F), pax7a (G et H), pax6b (I et J). Embryons injectés avec 4 ng de morpholino contrôle (A, C, E, G et I), 4 ng de morpholino (1) ciblant dhx34 (B, D, F, H et J). Les embryons sont présentés en position ventrale, partie rostrale orientée à gauche. di: diencéphale; te: tegmentum; rev: rhombencéphale ventral; ep: épiphyse; teo: tectum optique; ce: cerebellum; pr: couche photoréceptrice.

Barre d’échelle= 100 µm

Figure II.23: Structure du cerveau

Le cerveau du poisson zèbre est divisé en 3 grandes parties: le proencéphale (FB) ou cerveau antérieur, le mésencéphale (MB) ou cerveau moyen et le rhombencéphale (HB) ou le cerveau postérieur. Le proencéphale (délimité par des pointillés) est constitué du diencépahle (Di) et du télencéphale (Tel). Le mésencéphale comprend le tectum optique (TeO) et le tegmentum. Le rhombocéphale (délimité par des flèches) comprend le cervelet et le bulbe rachidien. Vue latérale d’un embryon de 5 dpf marqué par un anticorps contre la tubuline acétylée. Les yeux et la peau de l’embryon ont été retirés. L’astérisque marque le tractus optique.Adapté de http://zebrafishbrain.org/tutorial.php

Résultats

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II.5 Effets sur d’autres tissus

Au cours de notre étude, nous avons prouvé que l’inhibition du NMD mène à une formation adénohypophysaire aberrante ainsi qu’un dérèglement des voies de signalisation Hedgehog, Fibroblast Growth Factor et Notch. Nous avons pu constater que ce dérèglement signalétique n’est pas restreint à l’hypophyse, mais touche tout l’organisme. Par conséquent, il est plus que probable que d’autres tissus soient également affectés par le blocage de la voie NMD. Grâce à l’injection du morpholino ciblant dhx34, nous fournissons ici une vue d’ensemble des principaux défauts affectant les divers systèmes biologiques à 48 hpf.