B Système nerveu

Au cours de notre étude du système nerveux, nous avons constaté que la diminution d’expression de dhx34 induit une forte diminution de l’expression de neurod1 et une forte augmentation de ascl1a à 48 hpf. Ceci est très intéressant, puisque ces deux facteurs bHLH impliqués dans la différenciation neuronale ont des domaines d’expression complémentaires (260, 262). Cette complémentarité est retrouvée chez la souris, chez laquelle les facteurs NEUROGENIN1 et ASCL1 représentent deux voies alternatives de neurogenèse (288, 289).

Les facteurs de transcription bHLH tels que NEUROGENIN1, NEUROD ou ASCL1 sont dits de type activateur puisqu’ils induisent la différenciation neuronale (données revues dans (290)). Leur expression et leur activité sont réprimées par d’autres facteurs bHLH, tels que les facteurs HES1 et HES5 (homologues des facteurs Her6 et Her2 du poisson zèbre), qui sont de type répresseur [FigureIII.3]. En plus de réprimer les facteurs bHLH de type activateur, ces facteurs HES permettent d’induire la prolifération des cellules souches neurales. L’expression de ces facteurs HES est directement contrôlée par la voie de signalisation Notch (289, 290). De ce fait, la voie Notch est impliquée dans la répression de la neurogenèse primaire et promeut la prolifération des progéniteurs neuraux (291–293). deltaA en particulier est exprimé au sein et au pourtour des centres prolifératifs du cerveau (260). De plus, la voie Notch est impliquée dans la segmentation du rhombencéphale via son action dans l’horloge de segmentation (voir plus loin) (253). La diminution de la signalisation Notch que nous constatons dans les morphants dhx34 devrait donc induire une diminution du taux prolifératif des progéniteurs neuraux et une augmentation de leur différenciation en neurones. L’augmentation d’expression de ascl1a pourrait donc être expliquée par la diminution de la voie canonique de Notch que nous constatons à 28 et 48 hpf ; par contre la diminution de l’expression de neurod1 doit trouver son origine dans un autre

Figure III.4: L’horloge de segmentation des somites: l’oscillation transcriptionnelle de Notch

Les somites dérivent du mésoderme présomitique (PSM), un tissu non segmenté, situé dans le bout de la queue de l’embryon. Les cellules du PSM sont spécifiées grâce au gradient morphogène établi par l’action combinée des signalisations FGF et Wnt provenant du bout de la queue. A l’endroit où le niveau des signalisations Wnt et Fgf tombe en dessous d’une valeur seuil, les somites se forment. On considère qu’au cours du développement une nouvelle paire de somites est formée toutes les 30 minutes chez le poisson zèbre. Le segmentation des somites nécessite une coordination cellulaire dans l’espace et le temps et est assurée par une expression génétique oscillatoire appelée « horloge de segmentation » qui sonne dans les cellules du PMS et dicte le rythme de la formation des somites. Chaque cycle oscillatoire correspond à la formation d’une paire de somites supplémentaire. Parmi les gènes oscillateurs les plus importants on retrouve les effecteurs de la signalisation Notch her1 et her7 chez le poisson zèbre. Ces effecteurs contrôlent l’expression de nombreux gènes dont delta C. Ces gènes oscillateurs présentent un profil d’expression caractéristique en hybridation in situ. Dans la partie caudale du PSM, le niveau d’expression peut être haut ou bas en fonction de la phase du cycle oscillatoire au moment où l’embryon fut fixé. Dans la partie rostrale du PSM, on peut voir un profil d’expression zébré, dans lequel des bandes de cellules exprimant fortement le gène oscillateur alternent avec des bandes de cellules qui ne l’expriment pas. Le profil d’expression reflète aussi le ralentissement progressif des oscillations au fur et à mesure que l’on s’approche du point de spécification des cellules du PSM en cellules somitiques; point au delà duquel l’oscillation est arrêtée. Les cellules conservent donc l’état dans lequel elles ont été arrêtées (bleu transparent vs blanc transparent) permettant la démarcation des frontières des somites (lignes noires).Tiré de

Lewis,J., Hanisch,A. and Holder,M. (2009) Notch signaling, the segmentation clock, and the patterning of vertebrate somites. J. Biol., 8, 44.

Conclusions & Discussion

68 processus. L’augmentation de l’expression de facteurs bHLH répresseurs par une voie Notch non-canonique pourrait constituer un tel processus.

A l’opposé de la voie Notch, la voie Shh est capable d’induire l’expression des gènes codants pour les facteurs bHLH activateurs Neurogenin1, NeuroD et Ascl1 dans les précurseurs neuronaux, et est donc un régulateur positif de la neurogenèse (294, 295). La voie Sonic Hedgehog est en effet connue pour son rôle essentiel et conservé dans la spécification neurale en agissant en tant que morphogène (296, 297). Un exemple de cette fonction morphogène est la croissance et la différenciation anisotropique (anisos : inégale/tropos : direction) des progéniteurs neuronaux de l’hypothalamus dirigée par la signalisation Shha provenant de la notochorde (298). La signalisation Shh a également une action mitogène, en activant la prolifération des progéniteurs neuraux (299, 300). L’augmentation de la voie Shh que nous constatons à 48 hpf lors de l’injection du morpholino dhx34 devrait altérer le gradient morphogène et donc déséquilibrer la différenciation neurale et augmenter le taux prolifératif des progéniteurs neuraux.

Aux effets des signalisations Shh et Notch, il faut adjoindre l’effet de l’augmentation de la signalisation Fgf3 constatée à 24 hpf. En effet, les signalisations Fgf3 et Fgf8, en redondance partielle, coopèrent dans le développement du prosencéphale et du mésencéphale (223, 278).

Afin d’étudier plus en profondeur l’impact qu’a l’absence de Dhx34 sur la neurogénèse et la formation du système nerveux, il serait intéressant de tester l’expression d’autres acteurs de la neurogenèse tels que neurogenin1 ainsi que la formation de la glie.

III.1.C

Système musculaire

La diminution d’expression de dhx34 induit une forte diminution de l’expression de l’un des facteurs principaux de la différenciation des cellules musculaires, myod1 ; ce qui suggère fortement une diminution de la myogenèse (268). Chez les embryons de poulet, une surexpression de Delta1 dans les somites en développement induit une forte diminution de l’expression de MyoD (301). Cette situation de surexpression d’un ligand Delta accompagnée d’une diminution d’expression du gène myod1, correspond bien à ce que l’on a pu observer chez les embryons injectés avec le morpholino dhx34 à 48 hpf. Il convient toutefois de remarquer que dans leur étude chez le poulet, Hirsinger et al. décrivent une suractivation de la voie Notch alors que dans notre cas nous avons une diminution de la voie Notch canonique. La voie Notch est également reconnue pour son implication dans le développement des somites, au cours duquel elle agit en tant qu’oscillateur transcriptionnel (240, 291, 292, 302). La structuration des

Figure III.5: Différenciation des cellules endothéliales et hématopoïétiques

Chez le poisson zèbre les cellules endothéliales et hématopoïétiques dérivent d’un progéniteur commun appelé hémangioblaste. Les hémangioblastes dérivent de cellules souches du mésoderme ventral (CSM). Le choix de destinée des hémangioblastes est régulée par la voie de signalisation Notch, qui réprime la destinée angioblastique et favorise la destinée hématopoïétique. Chez les vertébrés, l’hématopoïèse survient en deux phase: la première dite primitive forme principalement des érythrocytes tandis que la deuxième dite définitive produit les cellules souches hématopoïétiques (HSC) capables de proliférer et responsables de la production des différentes cellules hématopoïétiques durant toute la vie de l’organisme. Les angioblastes peuvent se différencier en cellules endothéliales (CE) artérielles ou veineuses, choix dirigé par les voies de signalisation Shh et Notch. Cette cascade signalétique favorise la destinée veineuse et réprime la destinée artérielle. La voie Shh provenant de la notochorde est capable d’induire la signalisation de Vegf dans les somites, qui à son tour va induire la voie Notch dans les angioblastes. Une voie alternative permet à la voie Shh d’outre-passer Vegf, via l’activation de Crlr (« Calcitonin receptor-like receptor ») afin d’activer la voie Notch. Les angioblastes forment également les cellules endothéliales (CE) hémogéniques de l’aorte dorsale. Grâce à l’action des voie Notch et Shh ces cellules endothéliales particulières sont capables de se différencier en cellules souches hématopoïétiques (HSC) via un processus appelé transition endothéliale – hématopoïétique. Les HSC sont responsables de la production des cellules hématopoïétiques définitives. La prolifération des HSC est favorisée par la signalisation Notch. Les évènements de spécification, différenciation ou prolifération cellulaire sont indiqués par une flèche noire. Les contrôles transcriptionels opérés par des voies de signalisation sont indiqués par une flèche orange. Adapté de Zhang,C., Patient,R. and Liu,F. (2013) Hematopoietic stem cell development and regulatory signaling in zebrafish. Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj., 1830, 2370–2374.

Conclusions & Discussion

69 somites est en effet dépendante de cycles continus d’activation et d’inactivation de l’activité transcriptionnelle de la voie Notch [Figure III.4].

La diminution de myod1 peut être le résultat de l’augmentation de la voie Hedgehog, puisqu’elle contrôle le domaine d’expression de myod dans les progéniteurs des myocytes (303). L’implication de la signalisation Hh dans la différenciation des muscles striés est bien établie, le nom du gène smoothened, smo pour slow muscles

ommited, un composant essentiel de la transduction intracellulaire du signal Hh décrit

même son action (304). La signalisation Shh provenant de la notochorde agit en tant que morphogène dans la détermination du type de fibre musculaire striée qui vont se différencier dans les myotomes. Un haut niveau de signalisation Hh va induire la différenciation des fibroblastes en fibres musculaires lentes tandis qu’un faible taux induit la différenciation de fibres musculaires rapides (303, 305–307).

Afin d’étudier plus en profondeur l’impact qu’a la diminution de dhx34 sur le développement musculaire, il serait intéressant de tester d’autres marqueurs de la myogenèse tels que myf5 ou myog.

Il est à noter que la réduction de la musculature via une diminution de l’expression de

myod1 induit également une réduction de la formation cartilagineuse et osseuse,

probablement en raison de l’interdépendance des tissus squelettiques et musculaires (268).

III.1.D

Système vasculaire

Bien que l’architecture globale du système vasculaire ne semble que peu compromise, l’absence de Dhx34 induit une altération de la formation des vaisseaux sanguins comme démontré par le profil d’expression du gène fli1a.

Les voies de signalisation Shh et Notch sont des déterminants essentiels de la formation des vaisseaux sanguins ainsi que de la différenciation des cellules sanguines [Figure III.5]. En effet, la voie Notch réprime le nombre de cellules souches mésodermiques entrant dans la lignée endothéliale et favorise les lignées hématopoïétiques primitives (308). Les voies de signalisation Shh et Notch sont impliquées dans une cascade signalétique commune lors de la formation des artères et des veines en favorisant la différenciation des angioblastes en cellules endothéliales artérielles et en réprimant leur différenciation en cellules endothéliales veineuses (309– 311). Les deux voies de signalisation favorisent également l’induction de la formation de cellules souches hématopoïétiques, responsables de la production des cellules hématopoïétiques définitives (308, 312–314). La voie Notch favorise également la prolifération des cellules souches hématopoïétiques. De plus, la voie Hedgehog est

Figure III.6: Régulation de la différenciation intestinale par les facteurs bHLH

Représentation schématique de la régulation du choix de destinée de cellules souches intestinales en cellule absorptive ou en cellule sécrétrice par des facteurs de transcription bHLH. (1) Dans une cellule souche intestinale, le récepteur Notch est activé par la liaison à un ligand Delta d’une cellule voisine. Suite à cette activation, le domaine intracellulaire de Notch est transféré dans le noyau. (2) Grâce à la formation d’un complexe avec RBP-J (= CBF1), il induit l’expression de facteurs bHLH répresseurs tels que Hes1. (3) Ces protéines Hes vont former des hétérodimères avec un facteur bHLH ubiquitaire et répriment ainsi la transcription de facteurs bHLH activateurs tels que Math1ou Ngn1. De ce fait, les gènes spécifiques à la lignée absorptive sont exprimés. (4) Dans une cellule sécrétrice en différenciation, Notch n’est pas activé et RBP-J réprime l’expression des facteurs bHLH répresseurs. (5) En l’absence de facteurs réprimant leur expression, les facteurs bHLH activateurs sont exprimés. (6) En formant un complexe avec un bHLH ubiquitaire, les facteurs bHLH activateurs vont activer la transcription de gènes spécifiques à la lignée sécrétrice. De plus, les bHLH activateurs vont induire l’expression de ligands Delta, ce qui active la signalisation Notch dans la cellule voisine. Adapté de Lee,C.S. and Kaestner,K.H. (2004) Development of gut endocrine cells. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 18, 453–462.

Conclusions & Discussion

70 impliquée dans la migration des progéniteurs endothéliaux à partir de l’aorte dorsale et favorise la croissance des vaisseaux inter-somitiques (313). Enfin les voies de signalisation Notch et Shh sont impliquées dans la formation et la croissance des vaisseaux intersomitiques (313, 315).

Les effets de l’augmentation de l’activité de la voie Shh et la diminution de la voie Notch que nous constatons lors de l’injection du MOdhx34, sont difficiles à prévoir puisque séparément, ces modifications de signalisation auraient des effets opposés. Par exemple, la diminution de la voie Notch devrait lever la répression de la formation veineuse et donc restreindre la formation artérielle, par contre l’augmentation de la voie Shh devrait favoriser la formation artérielle au détriment de la formation veineuse. Etant donné que les voies de signalisation Hedgehog et Notch sont aussi impliquées dans la différenciation des lignées hématopoïétiques, il serait intéressant de tester l’expression de marqueurs des cellules sanguines.

Il nous faut remarquer que tant les vaisseaux inter-somitiques, dépendants des voies de signalisation Hedgehog et Notch, que les vaisseaux du plexus sous-intestinal, indépendants de ces voies, sont touchés par la diminution d’expression de dhx34 (269, 270). Les vaisseaux sous-intestinaux semblent être dépendants de la signalisation Bmp, il serait donc intéressant de tester l’activité de cette dernière lors de l’inactivation de l’expression de dhx34.