Production et contrôle des suspensions de bactériophages ARN F-spécifiques

Dans cette étude, trois bactériophages ARN F-spécifiques appartenant à trois

génogroupes différents de la famille des Leviviridae sont utilisés. Le phage MS2 du

génogroupe I est une souche référencée (ATCC 15597-B1), et les phages GA et Qβ

appartenant respectivement aux génogroupes II et III ont été fournis par le Professeur J. Jofre

(Université de Barcelone, Espagne). La production et le contrôle des suspensions de travail

des bactériophages ARN F-spécifiques et de leur bactérie hôte (Escherichia coli K12 Hfr,

ATCC 23631) sont effectués selon la norme ISO 10705-1 (1995). La préparation des réactifs

nécessaires à la production et au dénombrement des phages est décrite en annexe 1.

1. Production de la bactérie hôte Escherichia coli

La première étape consiste à produire une culture d’Escherichia coli K12 Hfr (E. coli K12

Hfr). Dans un second temps, des mesures de turbidité ainsi qu’un comptage des colonies

sont effectuées afin de situer la phase exponentielle de croissance bactérienne, phase durant

laquelle les bactéries sont les plus sensibles à l’infection par les bactériophages.

1.1. Production des cultures d’essai

Une culture mère d’E. coli K12 Hfr est ensemencée sur trois boîtes de milieu

MacConkey. Après 18 heures d’incubation à 37°C, cinq colonies rouges (lactose-positives)

sont sélectionnées et inoculées dans 50 mL de milieu liquide TYGB à 1% de glucose-calcium

(Annexe 1). Après cinq heures d’incubation à 37°C et sous agitation (100 rpm), 10 mL de

glycérol stérile (autoclavé 21 minutes à 212°C) sont ajoutés dans le milieu. La culture d’essai

est aliquotée et conservée à - 80°C.

1.2. Etalonnage des mesures de turbidité

La bactérie hôte E. coli K12 Hfr doit être en phase exponentielle de croissance lors de la

réalisation du dénombrement des phages infectieux. Le contrôle suivant vise à déterminer la

densité optique (λ = 600 nm) correspondant à ce stade.

67

Pour cela, 500 µL de culture d’essai sont décongelés et inoculés dans 50 mL de milieu

liquide TYGB à 1% de glucose-calcium. Le milieu est incubé à 37°C sous agitation (100 rpm)

et 1 mL de culture est prélevé toutes les 30 minutes pendant 3 heures 30. Sur chaque

échantillon, un dénombrement des bactéries cultivables (en UFC : Unité Formant Colonie)

sur milieu TYGA solide ainsi que la mesure de densité optique à une longueur d’onde (λ) de

600 nm sont effectués. Selon la norme ISO 10705-1 (1995), une densité optique comprise entre

0,3 et 0,5 correspond à la phase exponentielle de croissance de la bactérie et à une

concentration en bactéries cultivables de l'ordre de 10

7

UFC/100µL.

Lors de notre étude des valeurs de turbidité comprises entre 0,25 et 0,5, obtenues entre

150 et 200 minutes de temps de culture, correspondent à la phase de croissance exponentielle

de la bactérie. Pour ces valeurs de densité optique, les concentrations en bactéries cultivables

sont comprises entre 1,2.10

7

et 2,6.10

7

UFC/100 µL. Lors de l’étape de titrage des

bactériophages, les cultures bactériennes seront systématiquement prélevées entre 150 et 200

minutes et la densité optique sera contrôlée afin de se situer dans la fenêtre optimale pour

l’infection des bactéries par les phages.

2. Production et dénombrement des bactériophages infectieux

La production des bactériophages se fait par infection de la bactérie hôte E. coli K12 Hfr

dans laquelle ils se multiplient. Le dénombrement des phages infectieux est effectué par la

technique des plages de lyse qui ne permet pas la distinction des génogroupes.

2.1. Production des bactériophages

Les trois stocks de phages MS2, GA et Qβ sont produits selon le même protocole (ISO

10705-1, 1995), sans étape de traitement au chloroforme.

Pour cela, 500 µL de culture d'essai d’E. coli K12 Hfr sont inoculés dans 50 mL de

milieu liquide TYGB à 1% de glucose-calcium. La culture est incubée à 37°C sous agitation

pendant 18 heures afin d’obtenir une pré-culture en phase stationnaire avancée. Une seconde

culture est alors réalisée en inoculant 500 µL de la pré-culture dans 50 mL de milieu liquide

TYGB à 1% de glucose-calcium. Après 90 minutes d’incubation à 37°C sous agitation, le

phage est ajouté pour obtenir une concentration finale de 10

7

UFP/mL dans le milieu TYGB.

Après 5 heures d’incubation à 37°C, sous agitation, le milieu est centrifugé à 3000 g pendant

20 minutes. Le surnageant est filtré sur un filtre-seringue de porosité 0,22 µm (Millipore,

68

Millex GP, réf. 5CG033RS). La suspension phagique ainsi obtenue est stockée à 4°C, à

l’obscurité.

2.2. Dénombrement des bactériophages infectieux

2.2.1. Dénombrement des phages en suspension

Le dénombrement des plages de lyse s’effectue par la méthode en double couche,

toujours selon la norme ISO 10705-1 (1995).

Pour cela, 500 µL d’une culture d’E. coli K12 Hfr sont inoculés dans 50 mL de milieu

liquide TYGB à 1% de glucose-calcium. La culture est incubée à 37°C sous agitation (100

rpm). Deux séries de dilutions d’ordre 10 du stock phagique sont préparées dans du tampon

PBS stérile (Gibco, réf. 18912-014). Dans des tubes à hémolyse, sont déposés 2,5 mL de milieu

semi-solide TYGA à 1% de glucose-calcium en surfusion (50°C), 1 mL de suspension

bactérienne en phase exponentielle de croissance et 1 mL d’une dilution phagique

précédemment préparée. Le contenu de chaque tube est coulé sur boîte de milieu solide

TYGA puis incubé à l’étuve à 37°C pendant 18 heures. Le décompte des plages de lyse est

réalisé afin de déterminer le titre du stock phagique en UFP/mL (UFP : Unité Formant

Plage).

Les stocks phagiques obtenus après la production présentent une concentration de

l'ordre de 10

11

UFP/mL pour les phages MS2 et Qβ et de l'ordre de 10

10

UFP/mL pour le

phage GA. Ce protocole est utilisé pour la quantification des bactériophages infectieux dans

les suspensions de travail, ainsi que dans les échantillons d’eau et sur les surfaces des

réacteurs. Dans le dernier cas un protocole d’élution-concentration est appliqué au préalable

(Helmi et al., 2010).

2.2.2. Elution-concentration des phages présents sur les surfaces

Pour la détection des bactériophages infectieux sur les coupons, une étape

d’élution-concentration est nécessaire. Nous avons choisi de suivre le protocole décrit par Helmi et al.

(2010).

• Elution des bactériophages

Lors de l'étape d'élution, les coupons sont immergés dans 20 mL de tampon d’élution

(1% d’extrait de bœuf, Glycine 50 mM, pH 9), puis traités aux ultrasons (Sonde à ultrasons

69

Vibra Cell ; puissance 250W, 20 KHz) à raison de deux traitements d’une minute à 20-25

Watts, les tubes étant immergés dans de la glace. Le coupon est maintenu à 1 cm de la sonde

à ultrasons. Les échantillons sont ensuite clarifiés par centrifugation à 1500 g pendant 10

minutes à 4°C. Le pH est ajusté à 7,2 par l’ajout d’HCl 1 M. L’éluat est ensuite conservé à 4°C

en attendant l’étape de concentration sur colonne.

• Concentration des phages sur colonne

L’étape de concentration des phages présents dans le tampon d’élution à l’extrait de

bœuf est réalisée sur des colonnes Macrosep (PALL Life Sciences). Les éléments constitutifs

d’une colonne Macrosep sont présentés sur la figure 15.

Figure 15. Eléments constitutifs d’une colonne de concentration Macrosep (PALL Life

Sciences).

Les 20 mL d’éluat sont versés dans le réservoir d’échantillon et concentrés par 2

centrifugations successives à 3 500 g pendant 1 heure à 4°C. Une étape supplémentaire de

centrifugation à 3 500 g pendant 15 minutes à 4°C est nécessaire pour obtenir un volume de

concentrat ne dépassant pas 2 mL. Le concentrat est récupéré en vissant la cupule de

récupération sur le réservoir d’échantillon, puis en centrifugeant la colonne à 3 500 g

pendant 2 minutes à 4°C. Si le volume de concentrat dans la cupule de récupération est

inférieur à 2 mL, il est complété avec du PBS stérile puis stocké à 4°C. A partir de ce

70

concentrat les phages infectieux sont dénombrés par la méthode des plages de lyse

(paragraphe I.2.2.1) et le génome viral est extrait puis quantifié par RT-qPCR (paragraphes

II.1 et II.2).

Dans le document Intéraction de bactériophages avec des surfaces colonisées par des biofilms d'eau potable et évaluation de protocoles de nettoyage (Page 89-93)