Procédures anatomiques

Toutes les étapes des procédures d'immunohistochimie ont été réalisées sous agitation.

3.1.3.1. Immunohistochimie DAT

Trois souris ont été profondément anesthésiées puis les cerveaux ont été fixés par une perfusion intracardiaque de 150 mL de NaCl 0,9% suivi de 250 mL de PFA 1%. Une fois prélevés, les cerveaux ont été post-fixés pendant 24 heures dans du PFA 1% à 4°C et placés dans du saccharose 30% pour cryoprotection. Les cerveaux ont ensuite été coupés en 6 séries de coupes coronales (40 µm) avec un microtome à vibration (MICROM HM 650 V, ThermoScientific, Science) conservées par la suite à -20°C dans une solution antigel composée de PBS 0,05 M contenant 0,19% de glucose, 37,5% d'éthylène glycol et 0,25% d'azide de sodium.

Pour chaque cerveau, une des 6 séries a été choisie pour l'immunohistochimie DAT. Les coupes ont été rincées trois fois dans du tampon salin contenant du Tris (TBS) 0,1 M pour éliminer toute trace de solution antigel. Ensuite, elles ont été traitées avec une solution de péroxyde d'hydrogène diluée à 0,6% dans du TBS 0,1 M pendant 15 minutes pour éliminer la péroxydase endogène qui pourrait créer un biais dans le signal par la suite, puis rincées de nouveau trois fois dans du TBS 0,1 M. Après un bain de 90 minutes dans une solution de blocage des sites aspécifques composée de TBS 0,1 M contenant 10% de sérum d'âne et 0,3% de triton X-100, les

125 coupes sont incubées 48 heures à 4°C avec un anticorps primaire fait chez le lapin dirigé contre le DAT (don du Pr Bertrand Bloch, CNRS UMR 5293) dilué au 1/5000 dans un nouveau bain de solution de blocage. Les coupes sont alors rincées trois nouvelles fois dans du TBS 0,1 M puis incubées 1 heure dans un anticorps secondaire biotinylé d'âne dirigé contre le lapin (Jackson Immuno Research, USA) dilué au 1/500 dans du TBS 0,1 M contenant 5% de sérum d'âne et 0,3% de triton X- 100. Après un nouveau cycle de 3 rinçages dans du TBS 0,1 M, les coupes sont incubées dans une solution de TBS avec 0,5% d'un complexe avidine-biotine pendant 1 heure et 15 minutes. Les coupes sont ensuite rincées trois fois dans du TBS 0,1M puis le marquage est révélé avec une solution de DAB (Sigma, USA) contenant 0,33% de péroxyde d'hydrogène. Les coupes sont ensuite montées, séchées puis couvertes dans un milieu de montage DePeX (VWR, USA).

3.1.3.2. Analyse stéréologique de la longueur des fibres dopaminergiques dans le cortex cingulaire et M1

Le cortex cingulaire (Cg) et M1 ont été définis grâce à l'utilisation d'un atlas stéréotaxique de souris (Paxinos and Franklin, 2001). Cg s'étend de 2,58 mm antérieur au bregma à 0,82 mm postérieur au bregma, et de la ligne médiane du cerveau jusqu'à l'apparition de couches horizontales pour la limite latérale. M1, quant à lui, s'étend de 1,1 mm antérieur au bregma à 0.94 mm postérieur au bregma. L'épaisseur plus faible de la couche IV et l'épaisseur importante de la couche V ont permis de définir les limites médianes et latérales de M1. La limite ventrale a été définie par la partie la plus dorsale du corps calleux. Les couches profondes de M1 s'étendent sur la moitié la plus ventrale de la structure, soit de 500 µm de la surface jusqu'à la limite dorsale du corps calleux, comme défini par Lev et White (1997).

126 Sur le nombre total de coupes de cerveau contenant M1 pour une série, nous avons quantifié la longueur de fibres marquées pour le DAT. Après l'immunohistochimie DAT, l'épaisseur des coupes a été mesurée à 11,97 ± 0,38 µm, ce qui correspond à un rétrécissement dû au traitement des coupes d'environ 70%. Pour utiliser l'analyse stéréologique par des sphères virtuelles de Mouton et al. 2002, les coupes ont été scannées à l'aide d'une caméra (Orca R2, Hamamatsu Electronic, Japon) connectée à un microscope (DM 5500, Leica, Allemagne). Par la suite, des sondes sphériques virtuelles de 4 µm de rayon incluses dans des zones de sondage carrées de 10 µm de côté sont superposées le long de l'axe Z de Cg et M1 grâce au logiciel Mercator (Explora Nova, France). L'espacement entre deux zones de sondage a été fixée à 50 µm. Les sphères peuvent ainsi être visualisées comme une suite de cercles concentriques de rayon croissant puis décroissant tout au long de la mise au point dans l'axe Z. Enfin, grâce à cela, les intersections entre la bordure extérieure du cercle visualisé et les fibres marquées pour le DAT ont été dénombrées par l'expérimentateur à chaque plan focal de la coupe. Afin d'éviter les biais causés par des effets de bord, une zone de garde mesurant 1 µm a été définie à chaque extrémité de la coupe. La longueur totale des fibres marquées pour le DAT a ensuite été calculée à partir de l'équation suivante:

L = β (∑Q)

où Q est le nombre d'intersections comptées, est le rapport du volume d'une zone

de sondage sur l'aire d'une sphère, F1 est l'inverse du nombre de coupes utilisées sur le nombre total de coupes (1/6), F2 est l'inverse de l'aire de l'échantillonnage et F3 est l'inverse de l'épaisseur de l'échantillonnage.

127 Toutes les valeurs données sont les moyennes ± erreur standard à la moyenne obtenues. De plus, les valeurs calculées ont été corrigées pour le rétrécissement de l'épaisseur des coupes.

3.1.3.3. Analyse de la distribution des fibres dopaminergiques dans M1

Afin d'analyser l'étendue rostrocaudale et médiolatérale des fibres dopaminergiques dans M1, nous avons utilisé les photographies des coupes utilisées auparavant pour l'analyse stéréologique. Pour chaque coupe, nous avons déterminé la surface occupée par les fibres marquées pour le DAT. Les résultats obtenus ont ensuite été reportés sur un graphique représentant la surface occupée par les fibres marquées pour le DAT en µm² en fonction des coordonnées de l'axe antéroposterieur. Les mesures ont été réalisées grâce au logiciel Image J 1.47v.