Animaux

Toutes les expériences menées sur les animaux ont été conduites en conformité avec les règles établies par le Ministère Français de l'Agriculture et de la Forêt (Décret 87849) et les directives de l'Union Européenne (2010/63/EU). Toutes les mesures nécessaires à la limitation du nombre d'animaux ainsi que la limitation de leur souffrance ont été prises en compte. Des souris femelles C57/Bl6 (Janvier, France) ont été maintenues dans des cages ventilées sous un cycle jour/nuit de 12h. De plus, les animaux ont eu accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum.

Afin d'étudier le rôle de la dopamine sur l'activité des neurones de projection de M1, nous avons choisi de travailler sur la souris adulte (3 à 6 mois) pour éviter les biais expérimentaux liés aux différences structurelles des cerveaux en cours de développement ou liés au vieillissement naturel du cerveau.

3.1.2. Procédures électrophysiologiques

3.1.2.1. _{Anesthésie et chirurgie}

Avant la chirurgie, les souris ont été profondément anesthésiées grâce à une injection intrapéritonéale (i.p.) d'Uréthane (1,8 g/kg) avant d'être installées sur un cadre stéréotaxique (LPC, France). L'efficacité de l'anesthésie a été contrôlée par l'examen du réflexe nociceptif induit par un pincement de la queue puis de la patte. Durant toute la durée de l'expérience, la température de la souris a été maintenue à

121 37°C grâce à un coussin chauffant équipée d'une sonde rectale. En cas de besoin, une dose additionnelle d'Uréthane (0,25 g/kg, i.p.) a été administrée quelque soit l'avancement de l'expérience. Un atlas stéréotaxique de souris a été utilisé pour placer les différentes électrodes et stimulations dans le cerveau des souris (Paxinos and Franklin, 2001).

3.1.2.2. _{Procédures électrophysiologiques}

Les enregistrements extracellulaires ont été réalisés à l'aide d'électrodes étirées à partir de capillaires en borosilicate (GC 150 F, Harvard Apparatus, Angleterre) avec une étireuse P-97 Flaming Brown (Sutter Instrument, USA). L'extrémité de l'électrode a ensuite été cassée à un diamètre de 2 µm puis l'électrode a été remplie avec une solution de chlorure de sodium (NaCl) 0,4 M contenant 2,5% de neurobiotine (Vector Labs, USA). Les électrodes avaient une résistance in vivo comprise entre 1β et β0 MΩ. Les électrodes d'enregistrement ont été descendues dans M1 (1,3-1,5 mm latéral au bregma et 1,0-1,5 mm antérieur au bregma) à une profondeur de 0,65 mm à 1 mm à partir de la surface du cerveau. Le signal obtenu est d'abord amplifié 10 fois, filtré (300 Hz-10kHz) puis encore amplifié 100 fois (MultiClamp 700-B, Axon Instruments, USA). Enfin, le signal est digitalisé (Micro 1401 mk II, Cambridge Electronics, Angleterre) puis acquis sur ordinateur grâce au logiciel Spike2 7.0 (Cambridge Electronics, Angleterre). A la fin de l'enregistrement, les neurones enregistrés sont marqués par une injection juxtacellulaire de neurobiotine (Vector Labs, USA) comme décrit par Pinault (1996). Brièvement, des pulses de courant positifs (250 ms, 2 Hz) sont appliqués à des intensités de courant croissantes (1-5 nA) jusqu'à induire une décharge importante du neurone. Immédiatement après l'injection de neurobiotine, les souris toujours anesthésiées ont été perfusées avec 150 mL de NaCl 0,9% et 250 mL de paraformaldéhyde (PFA) 4%

122 à l'aide d'une canule placée dans le ventricule gauche de la souris. Les cerveaux prélevés sont ensuite post-fixés 24 heures dans du PFA 4% à 4°C puis placés dans une solution de saccharose 30% à 4°C pour cryoprotection. Des coupes coronales de 40 µm contenant M1 sont par la suite réalisées grâce à un cryostat (CM 3050 S, Leica, Allemagne). Pour révéler la neurobiotine, les coupes sont rincées 3 fois dans une solution tampon phosphate (Phosphate Buffer Saline, PBS) 0,1 M puis les sites aspécifiques sont bloqués dans une solution de blocage composée de PBS 0,1 M contenant 3% d'albumine sérique bovine (Bovine Serum Albumin, BSA) et 0,3% de Triton X-100 puis incubées toute la nuit à 4°C dans un nouveau bain de solution de blocage contenant de la streptavidine Alexa 568 (Invitrogen, USA) diluée au 1/800 dans du PBS à 4°C. Les coupes sont ensuite rincées 3 fois dans du PBS avant d'être montées sur des lames gélatinées et couvertes avec un milieu de montage DePeX (VWR, USA). Afin de repérer les neurones de projection de M1 pendant l'enregistrement, nous avons stimulé de façon antidromique le striatum ipsilatéral au site d'enregistrement à l'aide d'une électrode concentrique bipolaire (SNEX-100, Rhodes Medical Instruments, USA) implantée dans le striatum dorsolatéral (0,2 mm antérieur au bregma, 2 mm latéral au bregma, profondeur 1,85 mm à partir de la surface cérébrale). Des stimulations électriques (0,5 ms, 600-800 µA) ont été appliquées toutes les 5 secondes grâce à un stimulateur externe (DS3; Digitimer, Angleterre) déclenché par un système 1401 Plus (Cambridge Electronics Design, Angleterre).

3.1.2.3. Procédures pharmacologiques

L'administration systémique d'un antagoniste ou d'un agoniste des récepteurs D2 a été réalisée grâce à l'implantation intrapéritonéale d'un aiguille connectée par un cathéter à une seringue remplie soit avec un agoniste des récepteurs D2

123 (quinpirole, 0,5 mg/kg, Sigma, USA), soit avec un antagoniste des récepteurs D2 (halopéridol, 0,5 mg/kg, Sigma, USA). Des injections de NaCl 0,9% ont également été réalisées pour servir de contrôle. L'agoniste ou l'antagoniste a été injecté après 30 minutes d'enregistrement de l'activité basale du neurone, puis l'activité électrophysiologique a été enregistrée pendant 45 minutes supplémentaires.

Pour l'administration locale intracorticale des produits pharmacologiques, nous avons utilisé des pipettes d'injection étirées à partir de capillaires en borosilicate (GC 100 FS, Harvard Apparatus, Angleterre) remplies avec du quinpirole 100 µM, du quinpirole 1µM ou du liquide céphalorachidien de synthèse (ACSF). La pipette a ensuite été descendue à proximité de la pipette d'enregistrement. Après l'enregistrement de l'activité basale du neurone pendant 5 minutes, 200 nL de solution ont été injectés par pression d'air puis l'activité électrophysiologique du neurone enregistrée pendant 15 minutes supplémentaires.

3.1.2.4. Analyse des données électrophysiologiques

Les enregistrements obtenus ont été analysés après l'expérience. La durée du potentiel d'action a été mesurée du début du potentiel d'action jusqu'au retour de la ligne de base de l'enregistrement. Pour évaluer la modulation pharmacologique de l'activité neuronale, la fréquence de décharge en potentiels d'action a été mesurée pour des durées d'enregistrement de 10 minutes ou de 1 minute selon qu'il s'agissait respectivement d'une injection systémique ou locale. Les durées de potentiels d'action, la réponse du neurone à la stimulation striatale et les fréquences de décharge ont été analysées avec le logiciel Spike2 7.0 (Cambridge Electronics design, Angleterre). Pour déterminer le patron de décharge des neurones enregistrés, nous avons utilisé l'analyse de bouffées du logiciel NeuroExplorer. Nous

124 avons considéré une bouffée comme étant une suite d'au minimum 2 potentiels d'action émis à une fréquence comprise entre 50 Hz et 100 Hz pour une durée minimum de 5 ms.