59 Le SED est un groupe de maladies génétiques rares qui conduit à des manifestations cliniques très diverses et de sévérité variable, touchant principalement les tissus conjonctifs comme la peau, les os, les articulations et la paroi des vaisseaux sanguins. Les premières formes de SED décrites présentaient des mutations au niveau des gènes codant les collagènes fibrillaires ou des enzymes intervenant dans leur biosynthèse ou leur maturation. Récemment, les GTs qui catalysent la biosynthèse des chaînes de GAGs sur les PGs ont également été impliquées dans ces syndromes. Malgré la différence d’origine de la déficience génétique, les symptômes observés chez les patients présentent des caractéristiques communes comme une hypermobilité articulaire, une hyperlaxité de la peau et un défaut de cicatrisation associés à des altérations multiples des tissus conjonctifs.
L’équipe MolCelTEG (Molecular, Cellular, Therapeutic Engineering and
Glycosyltransferases) s’est, depuis de nombreuses années, intéressée à la caractérisation structurale et fonctionnelle des GTs impliquées dans la biosynthèse des GAGs, en particulier aux enzymes responsables de la formation de l’amorce tétrasaccharidique (Bui et al., 2010; Gulberti et al., 2005; Talhaoui et al., 2010). Dans des travaux réalisés en collaboration avec le Centre de Génétique Médicale de Gent (Belgique), la présence de mutations au niveau du gène
B3GALT6 a été identifiée (Malfait et al., 2013; Van Damme et al., 2018). Les études biochimiques ont montré que les fibroblastes de derme de peau des patients atteints de SED présentaient une perte de l’activité de l’enzyme. Cet impact a pour conséquence d’induire un défaut de synthèse des GAGs membranaires et matriciels, associé à un retard de migration cellulaire par rapport aux cellules non déficientes. La diminution de la synthèse des GAGs va induire une altération de la structure et de la fonctionnalité des tissus qui, par extension, pourraient expliquer les symptômes observés chez ces patients atteints de SEDsp.
Néanmoins, les relations génotype-phénotype n’ont pu être complètement établies pour ce sous-type de SED, ainsi il n’est pas possible de prédire la sévérité des symptômes observés chez
les patients au regard des différentes mutations du gène B3GALT6. L’impact de ces mutations
sur la structure et la fonction de la protéine n’est pas non plus connu à l’heure actuelle et sera abordé dans ce travail. Par conséquent, il est impossible de savoir quelle sera l’importance du défaut de synthèse des PGs et donc de la désorganisation de la MEC, et par extension, de présager de la sévérité et de l’évolution des symptômes. Les cliniciens manquant d’informations sur ces points, la prise en charge des patients est compliquée à mettre en place du fait de l’évolution de la pathologie qui ne peut être prédite.
Sur la base des travaux impliquant la 3GalT6 dans la forme SEDsp (Malfait et al., 2017),
60 maladie en essayant de comprendre par quel(s) mécanisme(s) celles-ci affectent-elles la fonctionnalité et l’activité biologique de cette enzyme. Nous espérons ainsi mieux comprendre les relations existant entre la nature de la mutation de l’enzyme, les répercussions au niveau cellulaire et la sévérité des symptômes observés chez les patients.
Pour ce faire, nous proposons deux axes de travail :
(1) Le premier axe sera consacré à l’étude fonctionnelle et cinétique de la 3GalT6
recombinante humaine sauvage (et mutée le cas échéant) produite en système bactérien sous forme tronquée soluble. En parallèle, nous avons envisagé de réaliser la production de ces mêmes protéines en cellules d’insectes en collaboration avec le CERMAV à Grenoble. Mon travail a consisté à construire les vecteurs d’expression recombinants et à les fournir à nos collègues pour les premiers tests de production en cellules d’insectes. A l’issue de la production, l’enzyme recombinante produite sera purifiée et caractérisée d’un point de vue fonctionnel, afin d’apporter des informations sur l’impact des mutations sur la fonction de l’enzyme. La
caractérisation fonctionnelle de la 3GalT6 sauvage débutera par la détermination de ses
paramètres cinétiques vis-à-vis d’un substrat accepteur synthétique (un disaccharide fluorescent [Gal-Xyl-naphtyle] phosphorylé). La caractérisation structurale sera initiée par des études de
DLS (Dynamic Light Scattering) pour vérifier la stabilité et l’homogénéité de la préparation de
protéine purifiée et par la réalisation d’un modèle structural de l’enzyme pour comprendre l’impact des mutations sur la structure et potentiellement sur la fonction de la protéine. Ce
travail permettra d’envisager ensuite une étude des mutants de la 3GalT6 en nous focalisant
sur les mutations ponctuelles décrites chez les patients afin de fournir des informations sur l’impact des modifications de l’enzyme sur sa structure et sa fonction.
(2) Le second axe de l’étude vise au développement d’un modèle cellulaire déficient en
3GalT6 par invalidation du gène par la technique de CRISPR/Cas9. Ce modèle nous permettra
d’étudier les conséquences de l’extinction du gène B3GALT6 dans des cellules HeLa (lignée
humaine de cancer du col de l’utérus, exprimant la 3GalT6 et produisant des GAGs) en culture.
Après validation du modèle développé, les cellules déficientes pourront servir à évaluer le métabolisme cellulaire, en particulier les conséquences sur la production de GAGs. Par la suite,
une surexpression de la protéine sauvage et des mutants de la 3GalT6 sera réalisée pour
déterminer si les protéines mutées présentent ou non une activité enzymatique, et si elles conservent (ou non) la capacité à initier la biosynthèse des GAGs à partir d’un substrat
61 Ce projet permettra de fournir des informations sur les bases moléculaires de la déficience génétique en β3GalT6 ainsi que de comprendre ses répercutions cellulaires. Une meilleure connaissance du fonctionnement de cette enzyme dans le contexte des SED pourrait permettre une amélioration de la prise en charge des patients si la sévérité des symptômes et l’évolution de la pathologie peuvent être mieux prédites à partir d’une mutation donnée sur l’enzyme. A plus long terme, ces travaux pourraient permettre de proposer des stratégies thérapeutiques visant à s’opposer aux déficits observés dans les cellules déficientes et potentiellement à restaurer les fonctions biologiques associées.