20 Les syndromes d’Ehlers-Danlos (SED) sont un groupe de maladies génétiques rares des tissus conjonctifs touchant principalement les constituants des matrices extracellulaires (MEC) comme le(s) collagène(s) et les protéoglycanes (PGs). Les SED conduisent à des symptômes très divers, plus ou moins sévères, mais associés à des signes cliniques communs comme une peau fragile et élastique, des articulations hypermobiles et une fragilité généralisée des tissus. Dans les premières formes de SED décrites, les patients présentaient des mutations des gènes codant différents types de collagène ou codant les enzymes impliquées dans leur biosynthèse et leur maturation. Plus récemment, d’autres molécules matricielles (en particuliers les PGs) ont été impliquées dans des formes plus rares et sévères. Par exemple, des mutations du gène codant la β1,3-Galactosyltransférase 6 (β3GalT6), une glycosyltransférase (GT) impliquée dans l’initiation de la biosynthèse des PGs, ont été décrites et associées à la forme spondylo-dysplastique des SED (SEDsp) et à une autre maladie génétique du tissu conjonctif, la dysplasie spondylo-épimétaphysaire avec hyperlaxité ligamentaire de type 1 (SEMD-JL1), faisant des PGs des molécules pertinentes à étudier dans le contexte de ces pathologies.
Les PGs sont des macromolécules principalement situées dans les MEC et au niveau de la membrane plasmique des cellules. Grâce à leur position stratégique à l’interface cellule-matrice, ils jouent des rôles majeurs dans le maintien de la structure tridimensionnelle et l’organisation fonctionnelle des tissus conjonctifs. Ils sont par exemple particulièrement abondants dans la peau, le cartilage, les os, ou encore la paroi des vaisseaux sanguins. Les PGs sont également impliqués dans de multiples processus physiopathologiques comme la prolifération, la différentiation, la migration cellulaire ou encore la réparation tissulaire grâce à leur importante capacité d’interaction avec des effecteurs solubles comme les facteurs de croissance dont ils peuvent contrôler la biodisponibilité et l’activité biologique. Les PGs sont
composés d’un squelette peptidique appelé protéine core sur lequel sont fixées de longues
chaînes linéaires polysaccharidiques appelées glycosaminoglycanes (GAGs). La biosynthèse des GAGs implique de nombreuses enzymes de la famille des GTs et débute par la synthèse d’une amorce tétrasaccharidique commune aux différents types de GAGs [Acide
glucuronique-β1,3-Galactose-β1,3-Galactose-β1,4-Xylose-β1-O-]. Cette dernière servira d’amorce à la
polymérisation des différents types de chaînes de GAGs, qui seront simultanément maturés par diverses réactions d’épimérisation et de sulfatation, conduisant à une importante diversité structurale et fonctionnelle de PGs produits et expliquant leurs multiples fonctions cellulaires. Dans le cadre de ce travail de thèse, je me suis focalisé sur l’étude de la β3GalT6, l’enzyme responsable du transfert du troisième résidu (galactose) de l’amorce tétrasaccharidique sur la
21 avec le Centre de Génétique Médicale de Gent (Belgique), ont montré que des fibroblastes de
derme de peau issus de patients porteurs de mutations du gène B3GALT6 présentaient un défaut
de synthèse des GAGs associé à un retard de migration par rapport à des cellules non porteuses de la déficience génétique (Malfait et al., 2013; Van Damme et al., 2018). Sur la base de ces résultats et des récentes publications impliquant la β3GalT6 dans des maladies génétiques rares des tissus conjonctifs (comme le SEDsp et la SEMD-JL1), l’objectif de ma thèse a été de mieux comprendre l’implication de cette enzyme dans la pathogénie des SED et d’évaluer les conséquences fonctionnelles de cette déficience au niveau cellulaire.
Dans la première partie de ce travail, j’ai mis en place une étude fonctionnelle de la β3GalT6 recombinante humaine sauvage après optimisation de la production et de la purification d’une forme tronquée soluble de l’enzyme en système bactérien. En parallèle, une collaboration avec le Dr. François Hoh (UMR 5048 CNRS Centre de Biochimie Structurale, Montpellier) a conduit à la réalisation d’un modèle structural de la protéine qui a permis d’illustrer et de mieux comprendre l’impact des mutations observées chez les patients sur la structure et l’activité de l’enzyme.
Dans un deuxième temps, j’ai généré à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 un modèle cellulaire déficient en β3GalT6 afin de mieux comprendre l’impact de l’extinction du gène
B3GALT6 dans des cellules humaines, les cellules HeLa, choisies comme modèle de travail. Ce
modèle cellulaire B3GALT6 déficient a été caractérisé sur le plan moléculaire et utilisé pour
étudier les conséquences de l’absence d’expression de la β3GalT6 sur la biosynthèse des GAGs en particulier. De façon complémentaire, ce modèle déficient a permis d’initier l’étude des conséquences de la restauration de l’expression du gène codant la β3GalT6 (enzyme sauvage et mutants décrits chez les patients) pour analyser l’éventuelle restauration de la biosynthèse des GAGs dans ces cellules génétiquement modifiées. L’objectif de cette partie du projet est de déterminer les conséquences des mutations de l’enzyme décrites chez les patients en termes d’activité enzymatique et d’anabolisme des GAGs.
Ce manuscrit de thèse débutera par une introduction bibliographique présentant la classification et les symptômes cliniques des SED, ainsi que les différents traitements actuellement proposés aux patients. Les mutations des gènes responsables des différents types de SED seront présentées, en particulier celles décrites au niveau des enzymes codant la biosynthèse des GAGs, comme la β3GalT6, sur laquelle se focalise ce travail. Une partie consacrée plus précisément à la structure et aux fonctions biologiques des PGs (et des GAGs) sera présentée avec une description des processus de biosynthèse et de maturation de ces chaînes polysaccharidiques. La famille des β1,3-Galactosyltransférases (β3GalTs), en
22 particulier la β3GalT6, sera également décrite d’un point de vue fonctionnel dans la mesure où aucune information relative à la structure tridimensionnelle de cette enzyme n’est actuellement disponible. La problématique et les objectifs de ce travail seront exposés. Après une description détaillée des protocoles expérimentaux dans la section « Matériels et Méthodes », les résultats obtenus seront présentés en deux parties : une première partie dédiée à l’analyse fonctionnelle de l’enzyme recombinante humaine et une seconde partie présentant l’établissement du modèle
cellulaire B3GALT6 déficient et l’étude de la conséquence de la déficience en β3GalT6 sur la
synthèse des GAGs. Les résultats de chaque partie seront discutés avant de conclure et de présenter les perspectives de ce projet à court, moyen et plus long terme.
L’ensemble des résultats obtenus et à venir devrait permettre de mieux comprendre les relations génotype-phénotype de la pathologie par l’établissement d’un lien entre la nature de la mutation décrite, la gravité des symptômes des patients et l’évolution de la pathologie. Les réponses fournies pourraient permettre également une meilleure compréhension et prédiction de l’évolution de la pathologie, des points qui font défaut aux cliniciens à l’heure actuelle, pour améliorer la prise en charge des patients. A terme, ce travail devrait aussi contribuer au développement de stratégies thérapeutiques visant à s’opposer à la réduction d’anabolisme des GAGs et aux altérations fonctionnelles qui en résultent.