Principe de la SPRi - Imagerie par résonance des plasmons de surface

II. DEVELOPPEMENT D’UN BIOCAPTEUR

II.1. Imagerie par résonance des plasmons de surface

II.1.3 Principe de la SPRi

Il existe deux principales configurations de dispositif d’imagerie SPR sur puce. La première configuration, la moins répandue est celle dite par réseau de diffraction. Plutôt que d’augmenter l’indice de réfraction du milieu d’incidence comme cela peut être le cas avec un

prisme de verre traditionnel, il est possible d’augmenter le vecteur d’onde du faisceau incident en le faisant interagir avec un réseau de diffraction. Un faisceau incident frappe la surface de la puce _{présentant une nanostructuration périodique recouverte d’or. La lumière réfléchie est} captée par une caméra CCD. La réflexion du faisceau sera alors sensible aux interactions biomoléculaires qui se déroulent à la _{surface de l’or. Le principal désavantage de cette} méthode est que les faisceaux incidents et réfléchis doivent traverser le milieu couvrant et peuvent être perturbés par les variations optiques des liquides injectés.

Dans le cadre de ce travail, nous nous intéresserons à la deuxième configuration davantage répandue celle dite de Kretschmann. Pour un angle d’incidence θ de TIR particulier et une longueur d’onde fixe, l’énergie apportée par le faisceau incident va créer une onde évanescente capable de résonner avec l’onde électromagnétique du plasmon de surface et va induire une absorption photonique se caractérisant par une diminution d’intensité du rayon réfléchi ; cet angle est appelé angle de résonance plasmonique.

Les appareils commerciaux peuvent être basés selon trois configurations différentes. Lorsqu’un événement biologique se produit à l’interface métal / diélectrique et, si seule la longueur d’onde est fixée, l’énergie nécessaire pour exciter les plasmons de surface va changer et l’angle de résonance plasmonique va varier (interrogation angulaire, Figure 17A), au même titre que la longueur d’onde évoluera si l’on fixe l’angle d’incidence (interrogation spectrale, Figure 17B). Dans le cas d’un angle et d’une longueur d’onde fixe, l’intensité lumineuse va augmenter (interrogation en réflectivité, Figure 17A). A titre d'exemple, l’appareil de SPR commercialisé par BIAcore® _{est basé sur l’interrogation angulaire, il}

consiste à focaliser un fai_{sceau lumineux sur une surface d’or engendrant une résonance des} plasmons de surface à l’interface métal / diélectrique. Comme seule la longueur d’onde est fixe, la mesure des événements à l’interface est effectuée en mesurant le déplacement ∆θ du minimum de réflectivité (Figure 17A) de la courbe _{plasmon à l’aide d’une barrette de} photodiode.

Figure 17 : Différentes méthodes de mesure d’évolution des courbes plasmon lors d’un événement à l’interface : (A) ∆θ correspond à la mesure de la variation de l’angle d’incidence au minimum d’intensité réfléchie à longueur d’onde fixe lors d’un événement à l’interface (utilisé en SPR classique); ∆R correspond à la mesure de la variation de

réflectivité ou intensité réfléchie à angle et longueur d’onde fixes (utilisé en imagerie SPR). (B) ∆ correspond à la mesure de la variation de longueur d’onde au minimum d’intensité réfléchie à angle fixe.

Dans le cas de l’imagerie SPR, le système doit mesurer une variation de réflectivité ∆R lors d’une interaction biologique à l’interface. Comme pour la configuration SPR, le faisceau incident ne doit pas traverser le milieu qui, par sa composition diverse, pourrait perturber sa propagation. C’est pourquoi la configuration de Kretschmann qui consiste à exciter les plasmons par l'arrière du capteur grâce à un prisme est la plus répandue pour ce genre de biocapteur (Figure 16_{A). L’appareil SPRi-Plex II de chez HORIBA-Scientific, sur lequel les} développements présentés dans ce manuscrit ont été réalisés, est basé sur une méthode courante en imagerie SPR μ l’interrogation en réflectivité. En effet, l’interrogation angulaire nécessiterait un balayage du faisceau lumineux à un rythme adapté à la vitesse d’acquisition de la caméra, mais qui ne serait pas compatible avec la durée d’interaction biologique mesurée. Le schéma de principe du SPRi-Plex II est représenté en figure 18. Une source de lumière monochromatique émet un faisceau lumineux qui, une fois collimaté par une lentille, est polarisé en TM. Dans un premier temps, un miroir motorisé permet de faire varier l’angle d’entrée du faisceau dans un prisme de haut indice optique (np = 1.76). Le faisceau est dirigé,

avec un angle variable, vers la surface dorée de la puce ou du prisme. Le rayon réfléchi est alors capté par une caméra CCD, elle-même reliée à un ordinateur. L’intensité de la lumière réfléchie va pouvoir être enregistrée en fonction de l’angle d’incidence du faisceau incident émis par le miroir, il en résulte la courbe plasmon présentée en figure 17A.

Figure 18 : Représentation schématique du trajet optique de l’appareil d’imagerie SPR (SPRi-Plex II) utilisé au cours de la thèse.

La variation _{de réflectivité sera optimale lorsqu’une perturbation à l’interface provoquera} une variation maximale. Pour une sensibilité optimale, il faudra donc se référer à l’endroit de la courbe plasmon où la pente est maximale. Dans le cas de l’interrogation en réflectivité, il suffira, à longueur d’onde fixe, de choisir l’angle d’incidence de travail θt vérifiant

, ce qui est le cas pour le SPRi-Plex II ou à fixer un angle de travail et à choisir la longueur d’onde vérifiant . Dans les deux cas, la longueur d’onde et l’angle de travail sont fixés. Au-dessus du prisme doré ou de la puce d’or est disposé un appareillage microfluidique constitué d’une voie d’entrée, d’une cellule fluidique et d’une voie de sortie (Figure 18).

Dans le cas du SPRi-Plex II, la longueur d’onde est fixée à 810 nm puis, après balayage du faisceau grâce au miroir motorisé, l’utilisateur peut choisir l’angle de travail optimal à l’expérience. En effet, l’imagerie SPR permet de mesurer la variation de réflectivité moyenne sur des zones prédéfinies sur la surface de la puce par l’utilisateur. Ces zones que l’on nommera ROI (region of interest) sont de forme circulaire et de taille variable (30 à 8000 µm). Il peut être choisi jusqu’à 500 ROIs, qui sont en règle générale localisés sur les zones présentant les biorécepteurs. Le choix de l’angle de travail θt à fixer est commun à chaque

réaliser. Dans la pratique, θt sera fixé à la pente maximale de la courbe plasmon des ROIs

présentant le plus grand intérêt en s’aidant des valeurs de la dérivée affichées par le logiciel. Une fois l’angle de travail fixé, les interactions peuvent avoir lieu grâce à un dispositif fluidique ajusté à la surface de la biopuce (Figure 19_{). Ce dispositif est équipé d’une pompe} permettant la circulation du tampon de course, celui-ci est éliminé de ses bulles à _{l’aide d’un} dégazeur en amont de la pompe. Celle-ci est connectée à une valve qui selon sa position permet d’acheminer le tampon de course soit directement dans la cellule fluidique soit dans la boucle d’injection pour pousser l’échantillon dans la cellule.

Figure 19 : Représentation schématique du système fluidique SPRi-Plex II. Les deux configurations de la valve sont représentées. La première en position chargement qui consiste à injecter l’échantillon dans la boucle de chargement. La deuxième (dans l’encadré) représente la position de la valve en position injection, le tampon de

Lorsque la valve est en position « chargement », le tampon de course parcourt la cellule fluidique avec un débit _{contrôlé par la pompe et l’utilisateur peut alors charger la boucle} d’injection de l’échantillon qu’il désire faire passer sur la puce. La boucle d’injection est un tube en polyéther éther cétone (_{PEEK) de longueur variable selon les volumes d’échantillon à} injecter (généralement 200 ou 500 µL). Lorsque la valve est actionnée, le tampon de course, poussé par la pompe, est dirigé dans la boucle d’injection alors elle-même connectée à la cellule (encadré Figure 19) _{; l’injection a lieu.}

Au cours de l’injection de l’échantillon, va s’opérer une interaction biologique entre récepteurs fixés à la surface de la puce et cibles contenues dans l’échantillon, ce qui va induire une variation localisée de l’indice optique. Cette évolution d’indice va alors perturber la résonance des plasmons de surface se traduisant par une modification de l’intensité du faisceau réfléchi. Ces variations de réflectivité sont enregistrées au cours du temps (Figure 20A) et représentées sur un « sensorgramme » recueillant ainsi les données cinétiques de la phase d’association entre le récepteur immobilisé et la cible, suivie d’une phase de dissociation, une fois que le tampon de course circule à nouveau sur la puce (Figure 20B). En utilisant un modèle cinétique de Langmuir 1.1, il est alors possible de déterminer les constantes d’association et de dissociation pour le couple récepteur / cible et par extension la constante d’équilibre de la réaction aussi nommée constante d’affinité.

Figure 20 : (A) Evolution de la courbe plasmon avant (1) et après (2) une interaction à la surface de la biopuce, (B) suivi en temps réel de la variation de réflectivité décrivant la phase d’association et la phase de dissociation

Dans le document Développement d'une plateforme pour l'analyse sur puce d'un biomarqueur par couplage des technologies de résonance des plasmons de surface et de spectrométrie de masse (Page 64-70)