Analyse MS et MS-MS

Avant de tester la plateforme SUPRA-MS dans des milieux complexes, nous devons valider les prétraitements en vue de l'analyse MS et MS-MS sur une puce ayant capturé la protéine LAG-3 en milieu idéal.

IV.2.4.1 _{Capture de LAG-3 en tampon idéal pour analyse MS}

LAG-3 est injectée à 20 nM en tampon PBS Tween 0.05% en recirculation à un débit de 200 µL/min pendant 30 min conduisant à l'état d'équilibre de l'interaction biomoléculaire (Figure 81_{). Une injection de détergent d’OG permet d’évaluer la stabilité et la spécificité de} l'interaction Ag/Ac. L'antigène capturé induit une variation de réflectivité sur six spots A9H12 de 6 ± 1% (βσ) de RV, alors que nous ne constatons que 0.65 ± 0.18% de RV sur les spots anti-RSA et 0.31 ± 0.561% sur la surface conduisant à un rapport signal sur bruit de 9.5 et une bonne homogénéité de réponse à l'intérieur des spots.

De l'eau ultra pure est injectée à 50 µL/min en fin d'expériences pour éliminer les sels du tampon de course de la surface de la puce. La pompe est stoppée en cours d'injection pour éviter le retour du PBS sur la puce. La puce est retirée du SPRi-Plex II et sa surface est séchée. La puce est conservée à température ambiante dans une boite hermétique à la poussière en attente de l’analyse MS.

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Figure 81 : (A) Image SPR de la biopuce et définition des ROIs avant injection de LAG-3 des spots: IgGs A9H12 (rouge), IgGs anti-RSA (bleu), contrôle de la surface (vert). (B) Image différentielle à l’instant t (indiqué par un

astérix sur le sensorgramme (C)) après capture de LAG-3 injectée à 20 nM en tampon de course et injection d'OG.

(C) Sensorgramme enregistrée durant l'injection de LAG-3 suivie d'une injection d'octyle glucopyranoside (OG) (moyenne de 6 spots d'A9H12, 3 spots d'anti-RSA et 4 contrôles de surface).

IV.2.4.2 _{Analyse MS et MS-MS}

Le but de la technique SUPRA-MS est la détection multiplexée et la caractérisation des fragments peptidiques de la protéine d'intérêt grâce aux traitements automatisés nécessaires avant l'analyse MS. Pour éviter la contamination croisée entre les différents spots sur la puce, l'ensemble des traitements biochimiques, notamment la digestion enzymatique et le dépôt de matrice ont été réalisés par la technologie ImagePrep dont les optimisations et procédures ont été exposées au chapitre III.

La biopuce a été placée dans l'UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF par l'intermédiaire de la plaque MALDI modifiée pour accueillir les biopuces et dont la géométrie est définie dans le

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logiciel d'acquisition FlexControl (Bruker). L'acquisition automatique des spectres est rendue possible par la position exacte de chaque spot du pattern telle que définie dans la figure 65B par le spotter.

L'analyse par MALDI-MS a permis de générer des spectres de masse très peu bruités permettant d’isoler au moins 14 peptides spécifiques de la protéine LAG-3 dans une plage de mesure dont le rapport m/z est compris entre 900 et 4000 (Figure 82A). L'identification de la protéine LAG-3 après analyse PMF a conduit à un score de mascot significatif (> 87) par MS seule. Cette identification a été validée par l'analyse MS-MS du peptide à 1422.70 m/z pour lequel un score significatif a également été obtenu (> 56) (Figure 82B).

Figure 82 : (A) Identification par MS de LAG-3 (capturé en tampon) après prétraitement sur puce, (B) spectre MS-MS obtenu du pic 1422.70 m/z

Le nombre de peptides détectés et le recouvrement de séquence (SC = 37 %) (Figure 83A) sont similaires aux valeurs obtenues par une analyse protéomique classique utilisant la digestion enzymatique en phase liquide. Cette bonne corrélation et la répartition des peptides détectés au travers de la séquence de la protéine LAG-3 indique que la digestion sur puce est efficace.

De plus, l'imagerie MS confirme l'efficacité des différentes procédures de prétraitement sur puce, puisque la distribution du peptide spécifique à LAG-3 à 1422.70 m/z est visible exclusivement à l'intérieur des spots où a eu lieu la capture de LAG-3 ce qui indique qu'aucune délocalisation de l'information biologique ne se produit au cours des procédures de prétraitement des spots (Figure 83B). La zone extérieure des spots est couverte exclusivement par la RSA (pic 1960.50 m/z) qui est destinée à bloquer les interactions non spécifiques. Nous observons également de la RSA à l'intérieur des spots, ceci provient du greffage en faible

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proportion de la RSA lors de l'étape de blocage comme indiqué en figure 75. D’après la quantité de RSA greffée dans les spots A9H12 au paragraphe IV.1.3.13, la RSA peut être identifiée sur la puce à des quantités inférieures à la femtomole/spot.

Figure 83 : (A) Séquence de la protéine LAG-3 avec en surligné en gris les fragments utilisés pour l'identification de la protéine par MS et surligné en noir le peptide 1422.70 m/z. (B) Imagerie MS sur puce du peptide spécifique de

LAG-3 (1422.70 m/z) et la RSA (1960.50 m/z) et de leur superposition.

La distribution du peptide 1422.70 m/z révèle l'absence de délocalisation et de contamination croisée entre l'immobilisation des anticorps, la capture, le rinçage et les étapes de prétraitement MS.

Si on réalise un zoom sur une fenêtre de 1010 à 1235 m/z d'un spectre MS obtenu sur un spot A9H12, nous relevons en faible intensité des peptides d'anticorps et de RSA alors qu'apparaissent en plus forte intensité les peptides de la protéine LAG-3 (Figure 84). Nous émettons l'hypothèse que la couche supérieure de protéine est préférentiellement digérée lors de l'étape de prétraitement ce qui limite le nombre de peptides appartenant aux entités greffées sur la puce.

Figure 84 : Spectre des peptides après digestion et analyse d'un spot A9H12 contenant LAG-3 et l'agent bloquant (RSA)

162 IV.2.4.3 Limite d’identification MS

Afin d'établir la limite d'identification MS (LOI), A9H12 a été greffé à différentes concentrations de façon à générer des taux de capture variables de LAG-3 sur une même puce. Les analyses MS ont ainsi été effectuées sur des spots contenant de 0.1 à 10 femtomoles/mm2 de protéine LAG-3. Les résultats d'identification MS sont représentés en figure 85 et montrent qu'à partir de 1 femtomole/mm2 _{de LAG-3 capturé, 100 % des analyses}

permettent l'identification de la protéine LAG-3 avec un score Mascot significatif supérieur à 40 avec une moyenne de 71 ± 13. Une corrélation entre la quantité de protéine capturée et le score Mascot peut être observée à partir de différentes puces analysées (n = 5). Cela corrobore une très bonne reproductibilité des procédures de la SUPRA-MS en inter et intra puce. Dans une plage de 0.1 à 1 femtomole/mm2, nous observons davantage de dispersion avec seulement 40 % d'identification de LAG-3 dont 66 % significatif.

Figure 85 : Score Mascot en fonction du taux de recouvrement en macroarray en PBS

La limite d'identification par spectrométrie de masse de la protéine LAG-3 est donc fixée à un taux de capture sur puce de 1 femtomole/mm2, ce qui correspond d'après la gamme dynamique élaborée au paragraphe IV.2.2 à une concentration de 1.14 nM de LAG-3 en tampon soit 180 ng/mL.

IV.2.4.4 Limite de détection

L'identification des protéines est automatique et réalisée par le logiciel, mais l'identification n'est pas forcément nécessaire selon les applications. En effet, l'identification de la protéine est nécessaire si l'on recherche une protéine inconnue, dans le cas de la découverte de nouveaux biomarqueurs. Mais en diagnostic clinique, qui vise à valider ou non la présence du marqueur dans l'échantillon du patient, il est possible de ne s'intéresser qu'à un seul ou plusieurs peptides spécifiques au biomarqueur. Dans le cadre de notre étude, nous pouvons observer, en figure 86, que, sous la limite d'identification fixée à 1 femtomole/mm2,

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en moyenne 3 peptides appartenant à la protéine LAG-3 sont détectés. Ainsi, il est possible de définir une limite de détection (LOD) d’environ 0.γ femtomole/mm2 _{ce qui correspond à une}

concentration de LAG-3 de 0.25 nM.

Figure 86 : Nombre de peptides détectés en fonction du taux de recouvrement en macroarray en PBS

La distribution des peptides spécifiques de ce biomarqueur, grâce à l'imagerie MS, a permis de valider que les traitements qu'ont subi les puces, n'impliquaient pas de délocalisation des informations. Nous avons montré qu'il était possible de réaliser au niveau d’une femtomole, une analyse multiplexée et automatique pour la caractérisation de protéines issues d'interaction entre biopuces à anticorps et échantillons non complexes. Les résultats en PMF et MS-MS ont conduit à une identification significative d'un biomarqueur potentiel du cancer du sein en milieu idéal.