Activation ultrasonore

S’il est possible d'agir sur différents paramètres de greffage tel que le pH, la température, la concentration, la durée et l'utilisation de systèmes fluidiques pour déplacer les états stationnaires de ces réactions [230], dans le cas du greffage en gouttes, les mouvements fluidiques sont générés uniquement par les phénomènes thermodynamiques illustrés au paragraphe IV.1.3.3. De plus, les ligands sont confinés dans un faible volume limitant ainsi la

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quantité de molécules disponibles pour le greffage ce qui réduit son rendement comparé à un système fluidique. Un autre aspect limitatif concerne l'hétérogénéité possible dans le procédé de greffage entre les différents spots d'une même puce ce qui peut affecter la reproductibilité de la réponse de capture [226_].

Pour surmonter ces inconvénients, un système d'agitation pourrait être apporté au dispositif. Il existe deux principales technologies pour agiter des gouttes, l'électromouillage par diélectrique (EWOD) [231] et l'énergie de surface par onde acoustique (SAW) [232–234] également utilisée pour favoriser les interactions ligand/analyte sur le biocapteur [235]. Une approche EWOD pour la manipulation de gouttelettes a récemment donné des résultats intéressants pour la biofonctionnalisation de biopuces dans le domaine des puces à ADN [236]. Néanmoins, la complexité de l'appareil combiné avec la nécessité d'une surface hydrophobe de la puce semble être défavorable pour le développement de puces à protéine. Au sein de l'institut FEMTO-ST, une récente étude a été menée sur un dispositif 2D consacré à la réalisation d'un mélangeur acoustique à basse fréquence pour l'optimisation de greffage d'anticorps en spots [237]. Ce dispositif consiste à spotter les gouttes sur l'actionneur acoustique puis à appliquer la puce SPRi fonctionnalisée au contact des gouttes les confinant. Cette approche a montré l'augmentation de la vitesse de transfert d'anticorps à la surface de la puce améliorant ainsi la quantité de protéines greffées d’un facteur deux par rapport à une fluidique discrète passive. Néanmoins, le volume de 400 nL par goutte permet une incubation des anticorps de seulement 15 min car au-delà, il y a risque de séchage dû à l'absence d'environnement humide. De plus, le spotting de 5 spots est insuffisant pour une analyse multiplexée.

L'activation acoustique est commercialisée pour l'agitation de microplaque afin d’améliorer le mélange entre deux composés et augmenter ainsi les performances d’interactions biologiques dans le cas d’immunoassays par exemple [238_{]. Nous avons fait le}

choix de transposer cette méthode pour générer des mouvements fluidiques à l'intérieur des gouttes. Afin de générer des vibrations à la puce qui les transmettra aux gouttes, nous avons utilisé des ondes ultrasonores générées par un bac à ultrasons. Après spotting, le spotter est placé dans un bécher lui-même placé dans un bac à ultrasons (Elma) réglé à une fréquence de 37 kHz et à 30 % de sa puissance maximale (Figure 69).

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Figure 69 : Incubation des gouttes de solution d'anticorps dans le spotter et agitation ultrasonore.

Les ultrasons produits génèrent une élévation de la température de l'eau et donc de la puce. Pour maintenir une température équivalente à la température ambiante de la pièce, un système de refroidissement a été adapté au bac à ultrasons. Il est composé d'un serpentin en acier inoxydable plongé dans le bac branché sur un cryostat. Après optimisation, une température de 8 °C en sortie du cryostat permet de maintenir une température de l'eau du bac à 22 °C pendant toute la durée de l'incubation.

Il est difficile d'évaluer l'impact des ondes produites par le bac sur les mouvements fluidiques internes aux gouttes. Pour cela, nous avons procédé à des tests expérimentaux pour évaluer l'intérêt de cette technique en comparant les réponses en capture d'antigènes sur spots d'anticorps ayant subis ou non une activation ultrasonore pour un même temps d'incubation (10 min).

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Figure 70 : Homogénéité de capture d’un spot A9H12 ; sans (A) et avec agitation ultrasonore (B). (C) Sensorgramme montrant la cinétique de capture de LAG-3 sur une puce dont le greffage s’est déroulé sous activation

ultrasonore (noté « ON ») et une puce dont le greffage s’est déroulé sans activation (noté « OFF »). (B) Comparatif des taux de capture de LAG-3 entre spots ayant subi ou non une agitation.

L’image en figure 70A du spot sans agitation montre une hétérogénéité de capture due à un greffage préférentiel des anticorps au voisinage des bords de la goutte. Ce ne sont néanmoins pas les mêmes types d’effet de bords qu’en figure 67A où il s’agissait de zone qui avait séché. Le spot ayant subi une agitation lors du greffage répond de façon homogène sur la totalité du spot (Figure 70B). Les ROIs représentées par un cercle rouge sont disposées selon le pattern prédéfini par le spotter, c'est-à-dire que pour 16 spots, il y a 16 ROIs de diamètre (1 mm) légèrement inférieur au spot d’anticorps. Les ROIs macroscopiques sont centrées par rapport au spot et permettent la mesure SPR dans la même zone qui sera analysée ultérieurement par spectrométrie de masse. Des ROIs pourront être sélectionnées en dehors des spots pour mesurer les interactions non spécifiques sur la surface par exemple, on notera alors ces valeurs de réflectivité « surface _{» dans le sensorgramme et l’histogramme figure 70C} et D.

La cinétique en figure 70C montre la capture de LAG-3 sur spots A9H12 qui ont été soumis ou non à une activation ultrasonore. Les spots agités ont une réponse 1.5 fois plus élevée que les spots ayant incubés en statique (Figure 71_{D). Cette différence peut s’expliquer} par l’homogénéité de greffage obtenue par l’agitation des gouttes lors de l’immobilisation que l’on peut observer par imagerie SPR après capture de l’antigène (Figure 71B). L'activation

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ultrasonore a montré son efficacité et sera utilisée systématiquement pour les optimisations des autres paramètres de greffages.