Principe de l‘approche

HiSpOD est un logiciel de sélection d‘oligonucléotides pour biopuces à ADN développé pour améliorer la détermination des sondes réalisée à l‘heure actuelle par peu de logiciels (OligoWiz, ProbeMaker et OligoArray). Notre logiciel utilise une base de référence généraliste (ProtBase) comportant des données traitées représentant toutes les protéines connues correspondants aux séquences annotées, et leurs séquences CDSs présentes dans la banque de données EMBL et appartenant aux divisions procaryotes, champignons et environnement. Il permet de tester pour une séquence nucléique donnée dégénérée ou spécifique ou pour une séquence protéique, parmi tous les oligonucléotides possibles, ceux entraînant le moins d‘hybridations croisées suivant des critères bien précis qui seront décrits par la suite. La base utilisée pour le test de spécificité BLAST est générée avec un outil d‘interrogation et de construction de base de données FASTA suivant le souhait de l‘utilisateur.

3.1.1. Génération des sondes

HiSpOD accepte en entrée une séquence au format FASTA. Pour l‘exemple suivant, une séquence codant la sous-unité C de la MMOc (méthane-mono-oxygénase) intervenant dans les voies métaboliques du méthane est utilisée.

Mohieddine MISSAOUI Page 192 >gi|245213:412-1434 MMO gene cluster: mmoZ=gamma subunit of Protein

A...mmoC=Protein C [Methylosinus trichosporium, OB3b, Genomic, 3 genes, 1620 nt] ATGTACCAGATCGTCATCGAGACCGAGGACGGAGAAACCTGTCGTCGAATGCGGCCCAGCGAGGATTGGA TCTCGCGGGCTGAGGCAGAGCGTAATCTGCTCGCCTCCTGCCGAGCCGGCTGCGCCACCTGCAAGGCCGA TTGCACGGACGGCGATTATGAGCTGATCGATGTGAAGGTCCAGGCCGTGCCGCCGGACGAGGAGGAGGAC GGCAAGGTTCTGCTGTGCCGCACCTTTCCGCGCAGCGATCTGCATCTCCTCGTGCCTTACACCTATGATC GCATCTCCTTCGAGGCGATTCAGACCAATTGGCTCGCCGAGATCCTCGCCTGTGATCGCGTGTCGTCCAA TGTCGTGCGTCTCGTGCTGCAGCGCTCACGGCCGATGGCGGCGCGCATCTCGCTCAATTTCGTTCCCGGC CAATTCGTCGACATCGAGATACCGGGCACGCATACACGGCGCTCCTACTCCATGGCCTCGGTCGCGGAGG ATGGGCAGCTCGAATTCATCATCCGTCTGCTGCCGGACGGCGCCTTCTCGAAATTCCTGCAAACGGAAGC GAAGGTCGGCATGCGCGTCGATCTGCGCGGACCGGCGGGCTCGTTCTTCCTGCATGATCACGGCGGCAGA TCGCGCGTGTTCGTCGCCGGCGGCACGGGATTGTCGCCGGTGCTGTCGATGATCCGCCAGCTCGGCAAGG CGAGCGATCCGTCGCCGGCGACGCTTCTGTTCGGCGTCACCAATCGCGAGGAATTGTTCTATGTCGACGA GCTGAAGACTCTCGCGCAATCCATGCCGACCCTCGGCGTGCGCATAGCGGTGGTCAATGACGACGGCGGC AATGGCGTCGACAAGGGAACGGTGATTGATCTTCTGCGGGCCGAGCTCGAGATAGACTTGCTCCTTGGGC ACGCCCGCCGTCGCCGCCGCCGCGAAACGGCTCGATCATGCCGGGAGGACCACAGAGATAGATGTCCGGC TTGGCGTTCGGACTTTCTCGAGAAATTCCTGGCGAGCGGCTGA

Il s‘agit de générer à partir de la séquence d‘entrée de longueur L, toutes les sous-séquences d‘une longueur L₀. Ces sous séquences vont correspondre en réalité à un fichier où un ou plusieurs oligonucléotides spécifiques seront stockés. Le nombre absolu de fichiers créé est alors égal à N = L – L₀ + 1. Mais le nombre final de fichiers créés est N_f ≤ N. Dans l‘exemple, nous avons une séquence de longueur 1023 pb. HiSpOD est capable de générer jusqu‘à 1000 fichiers d‘oligonucléotides de 24 mers pour cette séquence. On obtient alors les fichiers suivants :

mmoC_ATGTACCAGATCGTCATCGAGACC_1_24.fasta >1 ATGTACCAGATCGTCATCGAGACC mmoC_TGTACCAGATCGTCATCGAGACCG_2_25.fasta >1 TGTACCAGATCGTCATCGAGACCG mmoC_GTACCAGATCGTCATCGAGACCGA_3_26.fasta >1 GTACCAGATCGTCATCGAGACCGA … mmoC_GAGAAATTCCTGGCGAGCGGCTGA_1000_1023.fasta >1 GAGAAATTCCTGGCGAGCGGCTGA

Comme indiqué précédemment, il est possible de soumettre une séquence dégénérée issue directement d‘un alignement multiple à l‘aide d‘outils tels que ConsensusMaker 1, Edtaln 2, ou MASH (Chappey et al., 1991). Cela permet de ne plus cibler un microorganisme en particulier mais de cibler tous les microorganismes ayant potentiellement l‘activité métabolique d‘intérêt. A —————————

1ConsensusMaker: http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html 2Edtaln: http://bioinfo.hku.hk/services/analyseq/cgi-bin/edtaln_in.pl

Mohieddine MISSAOUI Page 193 partir d‘une séquence protéique ou d‘une séquence consensus, la traduction inverse d‘oligopeptide est effectuée avec le programme présenté dans la partie III.2. Après la génération de tous les oligonucléotides, les tests de spécificité sont initiés. Il est également possible de donner à l‘entrée du programme une séquence générée à partir de l‘un des logiciels de génération de séquences consensus.

Que ce soit pour les séquences nucléiques dégénérées ou pour les séquences protéiques de références, HiSpOD génère pour chaque sous-séquence de longueur L₀ toutes les possibilités d‘oligonucléotides. Par exemple, pour le premier oligopeptide « MAATTESV » de longueur L₀ = 8 aa (équivalent à des oligonucléotides de 24 mers), on obtient 1×4×4×4×4×2×6×4=12288 oligonucléotides possibles d‘après notre algorithme de traduction inverse et sont enregistrés dans un fichier « mmoC_MAATTESV_1_8.fasta ».

3.1.2. Vérification des critères intrinsèques des sondes

Dans la conception d‘oligonucléotides pour biopuces à ADN, certains critères de sélection sont intrinsèques et propres à la séquence oligonucléotidique et dépendent donc uniquement de sa composition. HiSpOD offre la possibilité de déterminer la longueur, la température de fusion minimale, la température de fusion maximale (qui sont calculée à partir de l‘oligonucléotide en utilisant la méthode d‘ajustement II.1.2.3), le pourcentage de GC, la complexité (en termes de nombre maximal de bases consécutives identiques « stretch ») et la dégénérescence maximale autorisée pour un oligonucléotide dégénéré ou pour un oligopeptide. Un oligonucléotide dégénéré (respectivement un oligopeptide) qui ne vérifie pas ces critères n‘est pas retenu par la suite. Si au moins un des oligonucléotides générés pour une position donnée ne vérifie pas ces critères, alors l‘oligonucléotide (respectivement l‘oligopeptide) est supprimé et le fichier correspondant est supprimé. Par exemple, pour le fichier suivant :

unknown_ ATGTACCAGATCGTCATCGAGACY_1_24.fasta >1

ATGTACCAGATCGTCATCGAGACC >2

Mohieddine MISSAOUI Page 194 Nous avons les propriétés suivantes :

 Dégénérescence = 2

 Oligo N° 1

o Longueur = 24

o Pourcentage GC = 50 % o Température de fusion = 53.71 o Complexité = 2 Stretch de 2 bases C

 Oligo N° 2

o Longueur = 24

o Pourcentage GC = 45.8 % o Température de fusion = 50.80 o Complexité = 1 Stretch de 2 bases C

Si on avait fixé le pourcentage GC à 50%, seul l‘oligo N°1 serait gardé. On obtient alors le fichier suivant après cette étape. Cet oligonucléotide dégénéré ne sera pas sélectionné car il ne cible pas toutes les séquences possibles et par conséquent omet certaines espèces.

unknown_ ATGTACCAGATCGTCATCGAGACY_1_24.fasta >1

ATGTACCAGATCGTCATCGAGACC

3.1.3. Test de spécificité par recherche de similarité

Comme évoqué précédemment, la base de données utilisée pour HiSpOD est construite à partir de la base de données relationnelle ProtBase. Elle est formatée et fragmentée à l‘aide de mpi-formatdb, du package MPI-BLAST et est installée sur une machine SMP de 16 coeurs (Figure 65). L‘intérêt est de profiter de la puissance de calcul pour obtenir des meilleurs temps de conception puisque la recherche de similarité est l‘étape la plus couteuse en termes de temps de calcul. En fait, chaque fichier obtenu après l‘étape de vérification des critères intrinsèques est comparé contre la base de données. Nous avons vérifié que l‘utilisation d‘une base fragmentée avec le maximum de fragments augmente la performance du BLAST (Missaoui, 2006), la meilleure performance étant atteinte pour une valeur égale à N+1 coeurs si N est le nombre de fragments de base. Sachant que les performances pour x ≤ 16 processeurs et 15 fragments sont toujours meilleures que pour y < x et 15 fragments, nous avons choisi de fragmenter entièrement la base sur 15 fragments et d‘utiliser 16 cœurs pour obtenir les meilleures performances possibles.

Mohieddine MISSAOUI Page 195 Figure 65: Fragmentation de la base de données pour HiSpOD sur une machine de 16 cœurs.

Chaque oligonucléotide comparé donne un fichier de sortie BLAST. Nous traitons la sortie pour en extraire les séquences qui présentent potentiellement des hybridations croisées afin de vérifier les critères de Kane à savoir le pourcentage de similarité et le nombre de nucléotides consécutifs identiques. unknown_ ATGTACCAGATCGTCATCGAGACY_1_24.fasta.blast …… Identities = 24/24 (100%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 ATGTACCAGATCGTCATCGAGACC 24 |||||||||||||||||||||||| Sbjct 653 ATGTACCAGATCGTCATCGAGACC 672 ……

3.1.4. Vérification des hybridations croisées

L‘étape suivante consiste à parcourir le fichier de sortie BLAST et de construire une liste non redondante des identifiants de séquences qui croisent potentiellement avec les oligonucléotides d‘un même fichier d‘après les critères suivants fixés par l‘utilisateur :

 Le pourcentage d‘identité avec l‘oligonucléotide testé

 Le nombre de base consécutive identique « stretch » de similarité

Nous obtenons alors un fichier contenant les identifiants des séquences dans la base de données ProtBase. Ce fichier est un fichier intermédiaire contenant les identifiant des séquences dans la base de données. Il est traité dans les étapes suivantes.

Mohieddine MISSAOUI Page 196 unknown_ ATGTACCAGATCGTCATCGAGACY_1_24.fasta.blast.cross 12454 6546 45412 466 21546 64667 354 12164313 144445 …

3.1.5. Transformation de la sortie BLAST et création des groupes

d’hybridations croisées

La liste obtenue pour chaque fichier est transformée ensuite en un fichier au format FASTA en interrogeant la base de données relationnelle ProtBase pour en extraire les séquences nucléiques référencée par les identifiants précédemment extraits afin de définir les hybridations croisées potentielles. HiSpOD traite alors cette sortie pour créer un fichier d‘hybridation croisée en regroupant à l‘aide du programme BlastClust les séquences suivant deux critères fixés par l‘utilisateur :

 Le pourcentage d‘identité relatif

 Le pourcentage de la longueur prise en compte

Ces deux paramètres permettent d‘ajuster les groupes créés afin de regrouper ensemble les séquences qui présentent des similarités fortes pour factoriser les hybridations croisées fictives en hybridations croisées réelles. Le résultat final est donné sous forme de fichier résultat par sonde sélectionnée. De manière générale, les séquences identiques à la séquence de référence sont regroupées ensemble indiquant qu‘il ne s‘agit pas d‘une hybridation croisée, tandis que les autres séquences sont regroupées par groupe homogène du point de vu de la similarité. On obtient alors un fichier de sortie comme le suivant. Les groupes sont identifiés par leur couleur dans cet exemple. Mais en réalité, chaque ligne contient un groupe, les séquences d‘un même groupe sont séparées par un espace. Il s‘agit d‘un affichage qui sera amélioré ultérieurement.

unknown_ ATGTACCAGATCGTCATCGAGACY_1_24.fasta.blast.cross.clean Q8RQD4:1357:Pseudomonas_putid:4_hydrox B238971_77_p:1348:Pseudomonas_putid:4_h Q9S152:1346:Comamonas_testost:4_hydrox P51018:1285:Pseudomonas_putid:4_hydrox P51018:1282:Pseudomonas_putid:pyruvate Q9EVJ1:1282:Pseudomonas_putid:4_hydrox Q9EVJ1:1282:Pseudomonas_putid:4_hydrox Q9RA00:1282:Pseudomonas_putid:4_hydrox Q4J3S2:1201:Azotobacter_vinel:HMG_CoA_ AB238971_78_p:1144:Pseudomonas_putid:4_o

Mohieddine MISSAOUI Page 197 Q8RQD3:1144:Pseudomonas_putid:4_olaloc Q4J2W6:1113:Azotobacter_vinel:HMG_CoA_ Q4IUD1:1105:Azotobacter_vinel:HMG_CoA_ EP287753_2_p:1077:marine_metagenome:hypo EP287283_0_p:1058:marine_metagenome:hypo EP287283_2_p:1026:marine_metagenome:hypo EP287753_1_p:784:marine_metagenome:hypot EP617583_2_p:782:marine_metagenome:hypot EM702417_0_p:588:marine_metagenome:hypot EM542674_1_p:338:marine_metagenome:hypot Q2VLC5:3153:Burkholderia_cepa:BphF Q84EP5:1367:Cupriavidus_oxala:putative Q120N9:1359:Polaromonas_sp__J:pyruvate …

Chaque ligne du fichier résultats correspond à un groupe d‘hybridation croisée. En d‘autres termes, une hybridation croisée est considérée lorsqu‘on détermine un ensemble de séquences fortement homogènes et qui croisent systématiquement avec la sonde déterminée. La sortie est suffisamment détaillée pour retrouver exactement les séquences qui hybrident potentiellement avec la sonde. Chaque séquence qui croise potentiellement est identifiée par son numéro d‘accession