Chapitre I : Contexte et problématique biologique
4. Détermination de sondes pour biopuces à ADN
4.1. Principe des biopuces à ADN
Le principe de fonctionnement de la biopuce repose sur la complémentarité des bases entre les deux brins de l‘ADN. Physiquement, les puces à ADN sont des supports (lames de verre ou de silicium) sur lesquels sont régulièrement répartis des fragments d‘ADN simple brin appelés « sondes ».
Initialement, les sondes désoxyribonucléotidiques étaient fixées sur des membranes de nylon ou de nitrocellulose (macroarray : macro réseau) et les cibles étaient marquées par de la radioactivité (type 32P). Ce support, limité en terme de densité de sondes, a vite été abandonné au profit de lames de verre pré-activées par une chimie de surface permettant la fixation d‘un très grand nombre de sondes (microarray : micro réseau). Les sondes radioactives, quant à elles, ont été remplacées par des sondes fluorescentes en raison de leur flexibilité d‘utilisation (plusieurs fluorescences différentes permettant des détections simultanées) et de leur facilité de manipulation (absence des contraintes liées à la radioactivité). Les formats de la taille d‘une lame de microscope sont actuellement les plus répandus et apportent ainsi de nombreux avantages comme la haute densité, la possibilité de fixation covalente des sondes sur le support solide, la diminution de bruit de fond et la possibilité d‘hybrider simultanément au moins deux populations de cibles (Dharmadi and Gonzalez, 2004). Le choix entre les deux principaux types de biopuces ADN, ex situ ou in situ, sera dicté par la nature des sondes, la densité désirée et le coût (Dufva, 2005 ; Kawasaki, 2006).
La préparation des cibles consiste en un marquage permettant la reconnaissance par le système de détection des duplex sondes/cibles formés lors de l‘hybridation (Figure 4). La fluorescence est largement utilisée avec notamment l‘incorporation des cyanines (Cy3 et Cy5) qui présentent des spectres d‘émission de fluorescence bien distincts (respectivement 580-645 nm et 670-735 nm) et entraînent peu de bruit de fond (Ehrenreich, 2006). Plusieurs systèmes de détection ont été développés en fonction du type de plateforme utilisée. Les images des biopuces peuvent être obtenues à l‘aide d‘un scanner confocal ou non confocal, d‘un scanner détectant la lumière issue de réactions de chimioluminescence ou par détection électrochimique (Timlin, 2006 ; Ghindilis et al., 2007). La qualité d‘un scanner dépendra de la résolution de lecture (généralement 5-10 µm), du nombre de fluorescences détectées, des possibilités de lire
Mohieddine MISSAOUI Page 49 simultanément plusieurs fluorescences, de la vitesse de lecture, des capacités de chargement et de lecture automatique des biopuces et des logiciels de traitement des images associés. Des lectures d‘hybridations en temps réel sont également possibles (Marcy et al., 2008). Les images générées sont sauvegardées au format TIFF (Tagged Image File Format) sans perte d‘information (les pixels ayant généralement une gamme dynamique d‘intensité allant de 0 à 65 535). Ces images sont le reflet qualitatif et quantitatif des hybridations. L‘analyse des images nécessite plusieurs traitements successifs pour l‘exploitation des résultats (Ehrenreich, 2006).
Figure 4: Principe de la biopuce à ADN.
4.2. Critères de sélection
La première étape qui intervient dans la conception d‘une biopuce à ADN est la recherche de séquences qui jouent le rôle de véritables code-barres des molécules cibles à identifier (ARNm, ARNr, ADNg, ADNc, produits PCR) dans le milieu étudié. La sélection de sondes est donc une étape cruciale dans la conception de biopuces à ADN (Kreil et al, 2006). La recherche de séquences spécifiques doit être réalisée avec attention car plusieurs critères interviennent dans le choix des oligonucléotides :
l‘oligonucléotide ne doit pas s‘hybrider sur lui-même (formation de dimères) et ne doit pas former de structures secondaires.
la cible doit être facilement accessible.
Extraction des acides nucléiques
Marquges des cibles
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les hybridations croisées doivent être évitées afin de priviligier les hybridations spécifiques sondes/cibles.
température de fusion homogène pour tous les oligonucléotides permettant de réaliser des hybridations à une même température (Stekel, 2003).
La recherche de sondes spécifiques nécessite de faire appel à des comparaisons de séquences très lourdes en terme de temps de calcul. Des outils de comparaison de séquences ont été développés depuis une vingtaine d‘années pour rechercher les similarités de séquences. Parmi les programmes les plus utilisés, BLAST (Altschul et al., 1990) occupe une position privilégiée. En dépit des efforts entrepris pour proposer d‘autres outils d‘alignements locaux et globaux (FASTA, SAM, HUMMER, KALIGN, T-COFFE, MUSCLE, …), la recherche de similarité reste une tâche qui nécessite des temps de calcul très importants (Wu and Tseng, 2005 ; Chaudhary et al., 2005 ; Datta and Ebedes, 2005).
4.3. Les différents types de biopuces pour l’écologie microbienne
De nombreux types de biopuces ADN sont utilisables en écologie microbienne (Zhou et Thompson, 2002 ; Cook et Sayler, 2003 ; Ehrenreich, 2006 ; Gentry et al., 2006 ; Loy et Bodrossy, 2006 ; Sessitsch et al., 2006 ; Wagner et al., 2007). Ces biopuces apportent des informations sur la structure des génomes, leurs parentés, les expressions géniques, les capacités métaboliques, la structure et la dynamique des communautés microbiennes.
Les biopuces phylogénétiques oligonucléotidiques ou « Phylogenetic Oligonucleotide Arrays » (POA), ciblant les ADNr, sont actuellement le type de biopuces le plus largement utilisé pour étudier la structure et la dynamique des communautés bactériennes (Guschin et al., 1997 ; Small et al., 2001). Ces biopuces ont été utilisées pour caractériser:
Des groupes microbiens fonctionnels comme les sulfato-réducteurs (Loy et al., 2002), les nitrifiants (Kelly et al., 2005), les acidophiles (Yin et al., 2007; Garrido et al., 2008)
Des groupes taxonomiques comme les béta-protéo-bactéries de l‘ordre des Rhodocyclales (Loy et al., 2005), les entérobactéries (Lehner et al., 2005), les alpha-protéo-bactéries (Sanguin et al., 2006), les Pseudomonas (Sanguin et al., 2008), les cyanobactéries (Castiglioni et al., 2004), des environnements déterminés comme par exemple un sol pollué par l‘hexachlorohexane (Neufeld et al., 2006),
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L‘entière diversité d‘environnements complexes (Wilson et al., 2002 ; DeSantis et al., 2005 ; Brodie et al., 2006 ; Palmer et al., 2006 ; Huyghe et al., 2008 ; Militon et al., 2007).
La version haute densité de la PhyloChip, constituée de 506 944 sondes de 25 mers, permet maintenant la détection simultanée de près de 9 000 unités taxonomiques opérationnelles (Brodie et al., 2006 ; DeSantis et al., 2007 ; Brodie et al., 2007).
Les biopuces fonctionnelles permettent quant à elles d‘appréhender les capacités métaboliques des communautés microbiennes dans des environnements complexes. Ces biopuces ciblant les gènes fonctionnels ou « Functional Gene Arrays » (FGA) ont surtout été utilisées pour l‘étude des gènes impliqués dans les grands cycles biogéochimiques et dans les procédés de bioremédiation (Bodrossy et al., 2003 ; Rhee et al., 2004 ; Wu et al., 2004 ; Zhang et al., 2007).
La GeoChip composée de 24 243 oligonucléotides de 50 mers ciblant plus de 10 000 gènes impliqués dans les cycles du carbone, de l‘azote, du soufre, du phosphore mais aussi dans la dégradation de contaminants organiques et dans la réduction et la résistance aux métaux est la biopuce fonctionnelle la plus aboutie (He et al., 2007).
Les biopuces à oligonucléotides sont très largement utilisées du fait de leur facilité de fabrication. Cependant la détermination des sondes n‘est pas triviale et demande des capacités de calcul importantes.
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