Présentation antigénique

Des souris de 2 à 3 mois d’âge sont d’abord infectées à haute dose avec LCMV-WE (section 3.6 de ce chapitre). Vingt-quatre heures post-infection, les souris sont sacrifiées et leurs organes sont récoltés (section 3.7 de ce chapitre). À titre de témoins négatifs d’infection (groupe Mock), des souris C57Bl/6 non infectées d’âge équivalent à celui des animaux expérimentaux ont été hébergées et assujetties à des conditions identiques à celles des groupes expérimentaux. Pour simuler l’infection, ces animaux ont reçu par voie intraveineuse un volume de milieu de culture (MEM sans sérum) équivalent au volume de virus injecté aux animaux infectés.

5.1. Enrichissement et maturation de cellules CD11c+

Les rates sont déposées dans des tubes de 15 mL (Corning) contenant 5 mL collagénase D (Roche) à une concentration de 160 U/mL ou 1 milligramme (mg)/mL diluée dans du PBS

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contenant du Ca2+ (Invitrogen). Le contenu de chaque tube est versé dans des pétris stériles (Fisher) et les rates sont découpées en très petits morceaux, à l’aide de pinces et de scalpels stériles (Feather, Osaka, Japon). Après une incubation d’une heure à 37°C et 5 % de CO2, les

morceaux de rate sont transférés dans des tamis cellulaires de 100 µm et écrasés à l’aide du piston d’une seringue de 3 mL. Les suspensions cellulaires sont transférées dans des tubes de 15 mL et lavées (centrifugation de 5 minutes à 1 300 rpm). Après avoir jeté le surnageant, les globules rouges sont lysés avec 5 mL de NH4Cl 0.83 % (p/v; Sigma-Aldrich) durant 5 minutes à

TP. La lyse est arrêtée par l’ajout de 10 mL de PBS à chaque tube et les cellules sont ensuite lavées. Après avoir jeté le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 10 mL de tampon d’échantillon pour autoMACS11 et filtrées à travers de nouveaux tamis cellulaires de 100 µm. Un décompte cellulaire est fait et les cellules sont à nouveau lavées. Après avoir jeté le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 400 L de tampon d’échantillon pour autoMACS par tranche de 108 cellules. Cent L de billes magnétiques anti-CD11c (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne) sont ajoutés à chaque tube par tranche de 108 cellules et après avoir été mélangées, les cellules sont incubées 20 minutes à 4C. Les cellules sont lavées avec 10 à 20 fois le volume de marquage de tampon d’échantillon pour autoMACS. Après avoir jeté le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 500 L de tampon d’échantillon pour autoMACS par tranche de 108 cellules et les cellules CD11c sont séparées par tri magnétique automatisé grâce à une sélection double positive (autoMACS; Miltenyi Biotec). La fraction positive est récoltée et un nouveau décompte cellulaire est fait. Les cellules sont lavées avec du milieu de maintien12 et mises en suspension à une concentration de 5 x 105 cellules/mL. Cent µL de ces suspensions cellulaires sont déposés dans des puits séparés de plateaux de culture à fond rond de 96-puits. Afin de favoriser la maturation des cellules dendritiques isolées, 1 µg/mL de lipopolysaccharides (LPS; Sigma-Aldrich) est ajouté aux puits expérimentaux, ainsi qu’à certains puits témoins. Les plateaux sont ensuite incubés durant 16 heures à 37°C et 5 % de CO2.

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Tampon d’échantillon pour autoMACS: 0.5 % (p/v) BSA (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne) et 2 mM de EDTA (Fisher) dilués dans du PBS sans Ca2+ au pH 7.2.

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Milieu de maintien: RPMI supplémenté de 10 % (v/v) de SVF, 1 % (v/v) de Pénicilline/Streptomycine 100X, 1 % (v/v) de L- Glutamine 100X et 10 µM de β-ME.

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Afin de retirer le LPS des puits, les cellules sont lavées deux fois avec du milieu de maintien en centrifugeant directement les plateaux 96-puits durant 5 minutes à 400 rpm. Après le second lavage, 100 µL d’une suspension de lymphocytes T CD8 de souris P14 ou P14.SJL sont ajoutés aux puits contenant des cellules dendritiques.

5.2. Enrichissement de lymphocytes T CD8 de souris P14 ou P14.SJL

La rate de souris P14 ou P14.SJL phénotypées positives pour le TRC transgénique P14 est récoltée et préparée pour obtenir deux suspensions cellulaires indépendantes, tel que décrit à la section 3.4 de ce chapitre. Les cellules sont lavées (centrifugation de 5 minutes à 1 500 rpm) et remises en suspension dans 10 mL de tampon d’échantillon pour autoMACS. Avant de procéder au décompte cellulaire, les agrégats cellulaires sont éliminés en filtrant à travers de nouveaux tamis cellulaires de 100 µm. Les cellules sont ensuite lavées et après avoir jeté le surnageant, sont remises en suspension dans 90 µL de tampon d’échantillon pour autoMACS par tranche de 107 cellules totales. Dix µL de billes magnétiques anti-CD8a (Ly-2; Miltenyi Biotec) par tranche de 107 cellules sont ajoutés à chaque tube et après avoir été mélangées, les cellules sont incubées 20 minutes à 4C. Les cellules sont lavées avec 10 à 20 fois le volume de marquage de tampon d’échantillon pour autoMACS. Après avoir jeté le surnageant, les cellules sont remises en suspension dans 1 mL de tampon d’échantillon pour autoMACS par tranche de 108 cellules et les cellules CD8a sont séparées en tri magnétique automatisé par sélection positive simple au mode sensible (autoMACS). La fraction positive est récoltée et un nouveau décompte cellulaire est fait. Les cellules sont lavées avec du milieu de maintien et mises en suspension à une concentration de 106 cellules/mL. Cent µL de ces suspensions cellulaires sont ajoutés aux puits contenant des cellules dendritiques, en prenant soin d’utiliser les CTL transgéniques exprimant l’isoforme du CD45 correspondant à celui de chacune des souches de souris à l’étude. Les plateaux sont incubés durant 72 heures à 37°C et 5 % de CO2.

5.3. Incorporation de thymidine-3_H

Afin d’évaluer la prolifération des lymphocytes T CD8 mis en co-culture avec les cellules dendritiques, 0.44 microcurie (µCi) de thymidine [méthyl-tritium (3H)] (Perkin Elmer, Boston,

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MA, USA) dilué dans du milieu de maintien est ajouté à chaque puits. Les plateaux sont à nouveau incubés durant 16 heures à 37°C et 5 % de CO2.

Pour quantifier l’incorporation de thymidine-tritiée [méthyl-3H] par les cellules en prolifération, le contenu des plateaux est transféré sur des membranes filtermat (Perkin Elmer) à l’aide du Harvester (Tomtec, Handem, CT, USA). Après avoir séché les membranes, ces dernières sont imbibées de liquide à scintillation Ultima Gold (Perkin Elmer) dans un sac à échantillons (Perkin Elmer). Après avoir scellé les sacs, la radioactivité retenue sur les membranes est lue dans l’appareil Trilux 1450 MicroBeta (Perkin Elmer).