p25 p20-GFP Merge ' '
5.3. La présence de la protéine cprG sur les CMLs
Les cysteines proteinases eucaryotes de la famille de la papaïne sont retrouvées en abondance chez les microorganismes, les plantes et les animaux. Plus de 60 membres de cette famille ont été identifiés. Les enzymes lysosomales de D. discoideum ont deux types de modifications glucidiques. Une est une forme méthylée de Man-6-P (Mannose 6-Phosphate) sur les oligosaccharides liés. L'autre, nommée phosphoglycosylation, est l'ajout d'un GlcNAc-1-P (N- acetylglucosamine) dans une liaison phosphodiester à une serine. Ces modifications pourraient finalement jouer un rôle important pour séparer les enzymes lysosomales en différents compartiments en fonction de ces différences de
glycosylation (Mehta et al. 1997). Chez les cellules végétatives de D. discoideum, quatre membres de cette famille de cysteines proteinases ont été retrouvés (CP4, CP5, CP6 et CP7) (Sillo et al. 2011). Les cysteines proteinases qui sont exprimées lors de la phase végétative et lors de la phase de croissance de l'amibe D. discoideum jouent un rôle essentiel dans la dégradation des bactéries et permettent de fournir des nutriments au cours du développement cellulaire (Ord et al. 1997).
La combinaison des travaux de maîtrise de Valérie Paquet avec ceux présentés ici a permis de montrer que la protéine cprG, une cysteine proteinase majeure dans les cellules végétatives de D. discoideum (Gustafson et Thon 1979), est associée aux CMLs sécrétés. La protease cprG est aussi appelée cysteine proteinase 7 (CP7). C'est la deuxième fois qu'une cysteine proteinase est associée aux CMLs sécrétés. Emslie et al. (1998) ont utilisé les anticorps MUD 62 et MUD 166 qui reconnaissent un certain type de O- glycosylation pour montrer que la cysteine proteinase ddCP38B est également présente sur les CMLs sécrétés. Selon la littérature, ddCP38B est soit la cysteine proteinase CP4 ou la CP5, qui sont codées par les gènes cprD et cprE, respectivement (Champion et al.
1995). Le manque d'information sur l'antigène reconnu par les anticorps MUD 62 et MUD 166 empêche de déterminer si ddCP38B est CP4, CP5, ou les deux. Cependant, une étude récente a révélé que les cellules de D. discoideum sécrètent CP4 (cprD), CP6 (cprF), et CP7 (cprG) (Bakthavatsalam et Gomer 2010), ce qui suggère que ddCP38B est donc CP4. Il y aurait donc au moins deux cysteines proteases sur les CMLs sécrétés soit CP4 (cprD) et CP7 (cprG). Cette dernière, comme démontré dans la présente étude, est l'antigène reconnu par l'anticorps H36.
Les cystéine-protéinases tels que CP7 sont composées d'un peptide signal, d'une pro- région et d'un domaine catalytique. De plus, les CP7 exprimés pendant la croissance végétative ont un grand domaine riche en serine. Ce domaine est absent des autres membres de la famille papaïne chez les mammifères et les plantes. Sa fonction est inconnue, mais elle peut être impliquée dans la localisation de ces enzymes sur le lysosome (Ord et al. 1997). La pro-région de la CP7, qui maintient l'enzyme sous une forme inactive, est également impliquée dans l'association de ce type de proteases avec
les membranes (Mclntyre et al. 1994; Okamoto et al. 2001). La pro-région sert une variété de fonctions in vivo et in vitro. Elle est nécessaire pour le repliement de l'enzyme nouvellement synthétisé, l'inactivation du domaine de peptidases et la stabilisation de l'enzyme contre la denaturation en conditions de pH neutre ou alcalin (Yamamoto et al. 2002). Les proteases deviennent généralement actives et solubles par le clivage de la pro-région lorsqu'elles atteignent les lysosomes. CP7 est en principe sous sa forme active lorsqu'elle est associée aux CMLs sécrétés. Basé sur une analyse SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) (Letunic et al. 2012) de la séquence d'acides aminés de CP7, il a été déterminé que cette dernière ne contient pas de domaine transmembranaire. En outre, en se basant sur une analyse utilisant Predictor grand-PI (http://mendel.imp.ac.at/gpi/cgi-bin/gpi_pred.cgi) (Eisenhaber et al. 1999), il a été déterminé que CP7 ne contient pas de glycosylphosphatidylinositol (GPI). Cela soulève une question importante : comment CP7 est associée aux CMLs de même qu'à la membrane plasmisque? La cysteine proteinase associée à la membrane (MCP) de graines germées de Vigna mungo est un autre exemple d'une cysteine proteinase qui se lie à membrane dans sa forme active (Okamoto et al. 2001). Bien que le mécanisme d'association de MCP et de CP7 aux membranes ne soit pas connu, divers scénarios favorisant l'association de la cysteine proteinase activée (c'est-à-dire sans sa pro-région) aux membranes peuvent être proposés. Une possibilité est que les cysteines proteinases ont un motif protéique très hydrophobe qui est présent dans la forme active et qui a une affinité pour les membranes (Okamoto et al. 2001). Une autre possibilité est que les cysteines proteinases interagissent avec un récepteur sur les membranes. Dans le cas de CP7, l'identification d'autres protéines associées aux CMLs sécrétés pourrait apporter une réponse à cette question.
Les résultats obtenus par Valérie Paquet (Fig. 31) montrent que certains CMLs purifiés contiennent très peu de CP7. L'expression de CP7 a été rapporté par Dictyexpress (Rot et al. 2009) comme étant élevée dans les cellules végétatives, tout en diminuant rapidement pour devenir indétectable dans les 6 à 8 heures suivant l'enlèvement des nutriments. Puisque que la sécrétion des CMLs se produit tout au long du développement multicellulaire de l'amibe (Barondes étal. 1985; Fukuzawa et Ochiai 1993; Emslie et al.
1998), il est possible que les CMLs sécrétés dans les étapes ultérieures du développement multicellulaire de D. discoideum ne contiennent pas de CP7 par rapport à ceux sécrétés par les cellules végétatives.
DIC H36 DAPI
Kl
Figure 30. L'anticorps H36 marque partiellement des CMLs purifiés sécrétés. Les CMLs sécrétés ont été purifiés et soumis à une immunofluorescence avec H36 (V. Paquet, communication personnelle).
Sur la base des résultats en immunofluorescence (Fig. 14), seulement quelques protéines spécifiques de la voie endocytique de D. discoideum se retrouveraient dans les CMLs sécrétés. La protéine p80, un transporteur transmembranaire potentiel (Ravanel et al. 2001) reconnu par l'anticorps H161, n'a pas été détectée sur les CMLs sécrétés. Ce qui n'est pas surprenant étant donné que la protéine p80 est éliminé des CMLs au cours de leur formation (Marchetti et al. 2004).
Barondes (1985) a proposé que les CML sécrétés puissent jouer un rôle dans le développement multicellulaire en raison de la présence de la discoïdine I, une protéine qui a été identifié dans les CML sécrétés. La discoïdine I est sécrétée rapidement après que les cellules soient privées de nourriture. Toutefois, si c'est le cas, pourquoi des protéines comme les cysteines proteinases sont-elles ajoutées aux CMLs sécrétés? Les
CMLs sécrétés seraient-ils impliqués dans la dégradation de matières bactériennes à l'extérieur des cellules d'amibe par l'action des proteases qui y sont associées?
D. discoideum est un système modèle précieux qui a déjà prouvé son utilité dans l'étude de nombreux phénomènes biomédicaux, particulièrement ceux demandant la possibilité de générer facilement des mutants de gènes spécifiques (Annesley et Fisher 2009). On peut s'attendre à ce que D. discoideum puisse devenir aussi un modèle pour l'étude de la biogenèse et la physiologie des CMLs. De plus, l'identification de l'antigène reconnu par l'anticorps H36 fait en sorte que cet anticorps deviendra un outil fort utile dans le futur pour l'étude des CMLs sécrétés.