Confirmation de l'identification de la protéine reconnue par H

L'identification de l'antigène H36 a été confirmée par analyse Western blot où un anticorps spécifique pour cprG (AD-7.5) a été utilisé en parallèle avec l'anticorps H36. Après la préparation d'extrait cellulaire de l'amibe, une electrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) a été réalisée afin de séparer les protéines selon leur poids moléculaire. Ensuite, les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose.

échantillons protéiques n'étaient pas mélangés à du (.-merchapthoéthanol dans le gel SDS-PAGE alors que dans le second cas, du p-merchapthoéthanol était ajouté aux échantillons dans le gel. Des résultats antérieurs montrent que la protéine cprG est sensible à la réduction par le p-merchapthoéthanol (Ord et al. 1997). Ce composé a la capacité de dissocier les ponts disulfures. Il est apparu que les deux anticorps ont reconnu spécifiquement les mêmes bandes dans les deux conditions. Deux bandes ont été obtenues entre 46 kDa et 56 kDa par Western Blot sans p-merchapthoéthanol (Fig. 23) et trois bandes ont été obtenues aux environs de 25 kDa avec l'agent réducteur (Fig. 24).

kDa

4 6 -

H36 AD-7.5

Figure 23. Western Blot avec les anticorps H36 et AD-7.5 sur des protéines n'ayant pas été exposées au P-merchapthoéthanol. Pour chaque anticorps, il y a 2 bandes entre 46 kDa et 56 kDa et les deux anticorps ont reconnu spécifiquement les mêmes bandes.

B

Figure 24. Western Blot avec les anticorps H36 et AD-7.5 sur des protéines ayant été exposées au P-merchapthoéthanol. Trois bandes ont été obtenues aux environs de 25 kDa et les deux anticorps ont reconnu spécifiquement les mêmes bandes.

4.5. Confirmation de l'identification de la protéine

reconnue par H72

L'expression des protéines identifiées comme potentiel antigène de l'anticorps H72, c'est-à-dire p20 et p35, couplées à la GFP a été réalisée afin de les visualiser dans les amibes. Les gènes des protéines p20 (Fig. 25) et p35 (Fig. 26) ont été amplifiés par PCR et les amplicons ont été ligaturés dans le plasmide pSP73. Les clones obtenus ont été séquences par le service d'analyses biomoléculaires de l'institut IBIS (Québec, Canada). L'ADN des clones présentant des séquences identiques à celles attendues et correspondant aux gènes des protéines p20 et p35 a été ensuite libéré du vecteur en incubant ceux-ci avec les enzymes de restrictions BamHI et Xbal. Ensuite les inserts ont été purifiés et ligaturés dans le vecteur d'expression pDM323.

A

B

C

7500 H M . Cl 2500

_bl

500

al 500

b2

₅₀₀

_c2

Figure 25. Clonage du gène p20 dans le plasmide pDM323. A) Amplification par PCR du gène p20. Une bande de 500 pb (al) correspond à ce gène. B) Le plasmide pSP73 contenant le gène p20 a été coupé par les enzymes de restrictions BamHI et Xbal pour libérer l'insert. Deux bandes ont été observées, la bande supérieure de 2500 pb (bl) est celle du plasmide pSP73, tandis que la bande inférieure de 500 pb (b2) est celle de l'insert (la séquence codante du gène pour la protéine p20). C) Vérification de la présence du gène pour la protéine p20 dans le plasmide pDM323. Le plasmide pDM323 contenant le gène de la protéine p20 a été coupé par les enzymes de restrictions Xhol et BglII, une bande à 7500 pb (Cl) correspondant au plasmide pDM323 est visible tandis que la bande à 500 pb (C2) indique le gène p20. Les chiffres à gauche des photos indiquent la longueur en paire de base.

A

B

C

cl

7500

cl

2500

■3

₁₅₀₀

_c2

1000

alal 1000

Hb2

Figure 26. Clonage du gène p35 dans le plasmide pDM323 A) Amplification du gène p35. Une bande de 1000 pb (al) correspond à ce gène. B) Le plasmide pSP73 contenant le gène de p35 a été coupé par les enzymes de restrictions BamHI et Xbal pour libérer l'insert. Deux bandes ont été observées, la bande supérieure à 2500 pb (bl) correspond au plasmide pSP73, tandis que la bande inférieure de 1000 pb (b2) représente l'insert. C) Vérification de la présence du gène p35 dans le plasmide pDM323. Le plasmide pDM323 contenant le gène de p35 a été coupé par l'enzyme de restrictions Xhol. Une bande à 7500 pb (cl) correspondant au plasmide pDM323 est visible tandis que, la bande en 1500 pb (c2) indique le gène p35 plus une partie de 500 pb provenant du plasmide. Les chiffres à gauche des photos indiquent la longueur en paire de base.

Après clonage des gènes des protéines p20 et p35 dans le plasmide pDM323, l'electroporation a été utilisée afin de transférer ces vecteurs d'expression dans l'amibe. L'analyse par Western blot a été réalisée en utilisant l'anticorps Anti-GFP pour confirmer l'expression des versions GFP des protéines p20 et p35 dans les amibes (Fig. 27).

KDa 56 — p20 J _ DH1 p35 KDa 56 — p20 KDa 56 — ■ 46 ^ > 30 — 30 —

Figure 27. Western blot pour confirmer l'expression de GFP-p20 et GFP-p35. Les protéines p20 et p35 couplées à la GFP sont exprimées dans les amibes tel que démontré par la présence de bandes détectées par l'anticorps anti-GFP. Les cellules parentales DH1-10 (DH1) ont été utilisées comme contrôle.

Ensuite un Western blot a été fait en utilisant l'anticorps H72 (Fig. 28). Comme nous l'avons déjà mentionné, H72 est un anticorps monoclonal et une seule des protéines p20 et p35 devrait se lier à l'anticorps H72. Nous nous attendions à observer une bande à 70 kDa (le poids moléculaire de la protéine p25 plus celui de la GFP), mais aucune de ces deux protéines n'ont été détectées par l'anticorps H72. Cependant, il est connu que l'anticorps H72 ne donne pas de bons résultats en Western Blot. Il est possible que 1'epitope de cet anticorps soit bloqué ou altéré lors du Western blot comme c'est le cas pour l'anticorps H161 (S. Charette, communication personnelle).

™ P

p20 _____ DH1

kDa

56-

46-

Figure 28. Western blot par l'anticorps H72. Les protéines p20 et p35 n'ont pas été détectées par cet anticorps. Les cellules DH1 ont été utilisées comme contrôle et une bande très faible à 25 kDa corresponde la protéine p25.

Puisque la détection des protéines n'était pas possible par Western blot dû à la faible efficacité de l'anticorps H72 pour cette méthode, 1'immunofluorescence a été utilisée comme alternative. Cela est possible puisque l'anticorps H72 génère un signal facile à observer par cette technique (Fig. 14). Ainsi pour confirmer si p20 ou p35 est l'antigène de H72, des cellules exprimant l'une ou l'autre de ces protéines couplées à la GFP ont été fixée et marquées avec l'anticorps H72. En principe, si p20 ou p35 est l'antigène de H72, le signal de la GFP (vert) et celui obtenu pour l'anticorps (rouge) devrait être quasi identique. Si cela est le cas, des zones dans la cellule seraient jaunes (vert+rouge). Or, autant pour la protéine p35 que pour la protéine p20 (Fig. 29), aucun signal jaune n'est visible. Ainsi, l'antigène de H72 n'est ni p35 ou p20.

p25

p20-GFP

Merge

p20-GFP

p25

p35-GFP

Merge

Merge

Figure 29. La vérification de la localisation des protéines p20-GFP et p35-GFP dans des cellules de D. discoideum. Les cellules ont été incubées avec l'anticorps H72, La protéine p25 est localisée à la surface de la membrane et dans les structures intracellulaires (rouge). Le signal GFP permet de détecter la localisation des protéines p20 et p35 (vert).