1. Pré-traitement des échantillons.
Avant de procéder à l’extraction de l’ADN des échantillons anciens, ils subissent un traitement préalable dans le but, entre autre, d’éliminer les possibles contaminations de surface. Ce traitement est spécifique à chaque type d’échantillon.
Les dents ont en premier lieu été nettoyées, une par une, et les éventuels résidus (terre, os, colle…) ont été retirés à l’aide d’un scalpel stérile. Ensuite, les dents ont été rincées à l’eau ultra-pure (milli-Q, Millipore) à l’aide d’une compresse stérile, « frottées » à la javel, et enfin à nouveau rincées à l’eau ultra-pure (milli-Q, Millipore). Pour finir, les échantillons disposés dans des grips stérilisés ont été irradiés sous les UV pendant environ 15 minutes de chaque coté. Une fois ces échantillons anciens décontaminés, ils ont été réduits en poudre à l’aide d’un cryobroyeur à azote liquide [6870 SamplePrep Freezer Mill® (Fisher Bioblock)], ce qui permet d’éviter les échauffements pouvant induire une dégradation de l’ADN. La poudre de dent ainsi obtenue a été disposée dans un tube 50 mL individuel pour chaque échantillon, ceux-ci ayant été conservés à l’abri de la lumière dans un endroit où seul des échantillons anciens étaient conservés.
Comme pour les dents, les échantillons osseux anciens ont tout d’abord été nettoyés, et les résidus éventuels (terre) éliminés à l’aide d’un scalpel stérile. Par la suite, la surface des fragments d’os longs (pour la plupart des fémurs) a été abrasée mécaniquement sur une épaisseur d’environ 2 mm, à l’aide d’une perceuse de type Dremel®(Breda), sous une hotte consacrée à cet usage. Enfin, ces fragments d’os longs abrasés ont été trépanés grâce à une perceuse à colonne équipée d’un trépan chirurgical afin d’obtenir de la « poudre » d’os. Cette poudre a également été disposée dans un tube de 50 mL individuel, puis conservée dans un endroit dédié à la conservation des échantillons anciens.
2. Extraction de l’ADN.
2.1. ADN ancien.
L’extraction est l’une des étapes les plus importantes du processus d’analyse de l’ADNa. Depuis la publication des premières études, les protocoles d’extraction ont considérablement évolué et sont encore continuellement améliorés (Campos et al., 2011; Rohland et al., 2010). Au cours de ce travail, différentes techniques d’extraction ont été testées puis la technique présentant le meilleur rendement a été conservée pour le traitement de l’ensemble des échantillons.
La première des deux méthodes testées est fondée sur l’utilisation du kit PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems). Ce kit est présenté comme permettant d’améliorer la quantité et la qualité de l'ADN extrait à partir d'échantillons d’ADN dégradé et présent en faible quantité, ce qui augmenterait le rendement des analyses réalisées en aval de l’extraction (Brevnov et al., 2009). Le kit PrepFiler™ utilise une combinaison de billes magnétiques et une chimie optimisée permettant de maximiser les performances de chaque étape de l’extraction : (1) la forte capacité de fixation des billes permet de récupérer un maximum d’ADN, (2) la fixation est très stable ce qui permet une étape de lavage efficace et donc de maximiser l'élimination des inhibiteurs de la PCR, tout en minimisant la perte de l'ADN, (3) le rendement de la quantité obtenue après élution est stable et maximal.
La deuxième méthode d’extraction testée est fondée sur l’utilisation d’un autre kit, le kit NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel). Le principe d’extraction de ce kit est fondé sur l’utilisation d’une colonne avec membrane de silice. Le kit NucleoSpin® Extract II est conçu pour la purification directe de produits PCR et pour la purification de l'ADN sur gels d'agarose. Ce kit, conçu pour éliminer les traces d'amorces inutilisées, et dans le même temps pour purifier les produits de PCR jusqu'à 65 pb, garantit la récupération de tous petits fragments d'ADN purifiés avec un rendement élevé. Même si ce kit n’est pas directement conçu pour l’extraction d’ADN à partir d’échantillons anciens osseux, nous avons choisi d’adapter le protocole à nos applications, car il présente des caractéristiques intéressantes.
Les différentes étapes d’extraction de ces deux kits sont présentées sur la figure 14 suivante (p.95).
94 Deuxième partie : Matériel et méthodes.
Les tests réalisés avec ces deux kits ont montré que le rendement était nettement meilleur avec l’utilisation du kit NucleoSpin® Extract II. Ce protocole a donc été utilisé pour l’extraction de l’ensemble des échantillons, suivi par une étape finale de concentration de l’ADN grâce à l’utilisation d’amicons (Y M-30 ; Sigma). Cette étape de concentration permet d’éluer l’ADN dans le volume le mieux adapté, et d’obtenir une concentration optimale pour réaliser différentes analyses par la suite.
2.2. ADN moderne.
Certains échantillons contemporains correspondant à ceux des manipulateurs et fouilleurs ont été analysés. Ces ADN modernes ont été extraits à partir de cellules buccales (cytobrosses). Le kit d’extraction QIAamp® DNA Mini kit (Qiagen) a été utilisé pour réaliser ces extractions, selon le protocole décrit par le fabriquant.
Avant la réalisation de ces prélèvements, le consentement éclairé de tous les individus a été obtenu par écrit, conformément à la législation française. Ces échantillons n’ont en aucun cas été utilisés pour des recherches mais seulement pour la comparaison des profils génétiques avec les profils des échantillons anciens, afin de vérifier des éventuelles contaminations pas les manipulateurs ou fouilleurs.
3. Quantification de l’ADN extrait.
L’ADN ancien extrait a été quantifié grâce à une méthode de PCR en temps réel utilisant le kit QuantifilerTM Human Identification (Applied Biosytems) avec le système de détection ABI PRISM® 7000 (Applied Biosytems), selon les recommandations du fabriquant.
Ce kit est destiné à estimer la quantité totale des molécules d’ADN humaine amplifiables dans un échantillon. Les résultats obtenus permettent d’obtenir plusieurs informations : (1) savoir si la quantité d’ADN humain détectée est suffisante pour procéder à des analyses génétiques telles que le séquençage ou le typage de SNP et/ou STR, (2) permet de savoir la quantité d’extrait à utiliser pour optimiser les réactions effectuée, (3) permet de détecter les potentiels inhibiteurs, et ainsi, d’adapter les protocoles d’analyse en conséquence.
Figure 14 : Présentation des différentes étapes des deux protocoles d’extraction testés au cours de ce
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