Préparation des mélanges de solutions en chloroforme
La première étape est de préparer les mélanges de solutions lipidiques en chloroforme suivant la composition souhaitée des membranes des GUVs.
250 µg de lipides (ou mélange de lipides) sont resuspendus dans 500 µL de chloroforme. On obtient alors une solution chloroformique à 500 µg/mL. Si on souhaite que la membrane soit marquée, on ajoute 1% (mol/mol) d’analogue de lipide fluorescent Egg Liss Rhod PE.
Ce mélange en solution chloroformique est conservé dans de petites fioles en verre (VWR® 548-1209) avec un bouchon en téflon à -20°C.
Préparation de la chambre d’électroformation des GUVs
Les GUVs sont formés par électroformation sur des lames d’Indium Tin Oxide (ITO) conducteur. L’ITO n’est déposé que d’un seul côté de la lame. Il est possible de détecter ce côté en mesurant la résistance électrique entre deux points d’un même côté de la lame. Le côté de la lame recouvert d’ITO est conducteur et possède donc une résistance finie.
Une bande de cuivre adhésif de 36 µm d’épaisseur est collée sur la lame, repliée des deux côtés de la lame. Du côté non conducteur, on soude un fil électrique sur le cuivre (Figure 70). On dépose ensuite 15 µL du mélange de solutions en chloroforme préparé ci-dessus à la surface de l’ITO sur chacune des lames. Ce dépôt est effectué à l’aide d’un patron circulaire représentant le joint qui servira à éloigner les deux lames lors de l’application du champ électrique. Les lipides doivent être étalés de la façon la plus homogène possible sur toute la surface à l’aide d’une seringue Hamilton (référence 80500/00).
Les deux lames sont ensuite placées sous vide pendant deux heures dans une boîte opaque (afin d’éviter la dégradation des sondes fluorescentes) pour retirer tout résidu de solvant.
Figure 70 : Chambre d’électroformation des GUVs. Cette chambre, présente deux compartiments permettant de former deux sortes de vésicules différentes.
Préparation du tampon de formation des GUVs
Le tampon utilisé lors de la formation des GUVs est composé de 240 mM de saccharose dissout dans de l’eau Milli-Q. La conductance électrique de ce tampon est : λin = 17,1 µS/cm
et l’osmolarité est : Osm = 240 mOsm/L.
Dans le cas des GUVs contenant du Calcium Green 2, la concentration souhaitée (25 µM ou 1,5 µM) de CaGr2 est ajoutée au tampon de formation.
Electroformation des GUVs
La formation des GUVs se fait à l’aide de l’application d’un champ électrique (Angelova and Dimitrov 1986). Les deux lames ITO sont superposées séparées par un joint de silicone (Cette chambre a été réalisée suite aux conclusions des travaux de C. Favard, E. Phez et J. Teissié). Les deux câbles électriques sont branchés à la sortie d’un générateur basse tension Exact®. L’amplitude des tensions délivrées par le générateur est contrôlée à l’aide du logiciel Picoscope®.
Selon la composition des GUVs souhaitée, les paramètres de formation peuvent différer.
GUVs composés de POPC, DOPC, Egg-PC, DMPC et DPPC :
On effectue la formation à 25°C pour POPC, DOPC, Egg-PC, à 30°C pour DMPC et à 50°C pour DPPC. On applique une rampe de tension sinusoïdale de fréquence 8 Hz de 25 mV à 1225 mV en augmentant de 100 mV en 100 mV toutes les cinq minutes. Ensuite, on maintient
la tension de 1225 mV durant une nuit. Puis on applique une tension créneau de fréquence 4 Hz et d’amplitude 1225 mV pendant une heure pour décrocher les GUVs formés.
GUVs composés de Egg-PC, POPC ou DPPC avec du cholestérol :
On effectue la formation à 40°C. On applique une rampe de tension sinusoïdale de fréquence 8 Hz de 25 mV à 1225 mV en augmentant de 100 mV en 100 mV toutes les cinq minutes. Ensuite, on maintient la tension de 1225 mV durant une nuit. Puis on applique une tension créneau de fréquence 4 Hz et d’amplitude 1225 mV pendant une heure pour décrocher les GUVs formés.
Les GUVs ainsi formés mesurent entre 10 et 80 µm de diamètre. Ils sont ensuite conservés dans des fioles en verre à 4°C pendant environ une semaine.
Les lames ITO sont ensuite nettoyées à l’éthanol puis à l’eau et peuvent être réutilisées.
Unilamellarité des GUVs produits par électroformation
Il a été montré que les GUVs produits par la méthode d’électroformation étaient unilamellaires (Mathivet, Cribier et al. 1996). Nous vérifions ici que dans nos conditions de formation, les GUVs produits sont effectivement unilamellaires.
Pour se faire, la première étape a été de former des GUVs constitués d’Egg PC et de 1% (mol/mol) de Egg Liss Rhod PE. Si on note f, la fluorescence par unité de surface pour une couche lipidique et F, la fluorescence totale du GUV, alors, dans le cas d’un GUV unilamellaire, on aura : F = 2 f S (avec S la surface totale du GUV). Le facteur 2 provient du fait qu’un GUV est formé d’une bicouche et donc de 2 monocouches lipidiques. Or, comme S = 4πr², alors Funi = 8πfr².
Dans le cas d’un GUV bilamellaire : Fbi = 16πfr². Pour des GUVs multilamellaires, on aura
donc : Fmulti = aπfr², avec a un multiple aléatoire de 8 supérieur à 8.
On mesure donc l’intensité totale d’une centaine de GUVs puis on trace F en fonction de r². Dans le cas où les GUVs sont unilamellaires, on attend une variation linéaire de la fluorescence totale en fonction de r² d’une pente égale à 8πf. Si les GUVs sont multilamellaires, nous attendrions un nuage de points au-dessus de la droite de pente 8πf.
Nous obtenons ici, une seule droite (Figure 71) indiquant que les GUVs produits par la méthode d’électroformation sont unilamellaires.
Figure 71 : Etude de l’unilamellarité des GUVs produits par électroformation. La fluorescence totale a été mesurée pour 100 GUVs On observe bien une variation linéaire de la fluorescence totale en fonction de r². Cette variation montre donc que les GUVs sont unilamellaires.