Préparation de la chambre d’électropulsation des GUVs
La chambre d’observation des GUVs est formée entre lame et lamelle. Sur la lame sont collées deux bandes de cuivre adhésif de 36 µm d’épaisseur séparées l’une de l’autre de 5 mm. De ce fait, le champ électrique appliqué est égal au rapport de l’amplitude appliquée à l’aide du générateur par la distance d entre les électrodes (0,5 cm pour les expériences d’électropulsation et 0,1 cm pour les expériences d’électrofusion) :
d V
E= . Sur ces deux bandes sont déposées deux épaisseurs de parafilm puis la lamelle. La chambre est ensuite déposée sur une plaque électrique chauffée 200°C pour faire fondre le parafilm et ainsi coller la lamelle. Des fils électriques sont ensuite soudés sur les bandes de cuivre dans le but d’appliquer un champ électrique dans la chambre d’observation entre les électrodes (Figure 72) (Cette chambre a été conçue par C. Favard).
0 100 200 300 400 500 600 0 150000 300000 450000 600000 750000 900000 1050000 1200000 r² (µm²) F lu o re s c e n c e t o ta le
Figure 72 : Chambre d’électropulsation des GUVs. Les GUVs, insérés entre lame et lamelle entre les deux électrodes de cuivre sont ensuite dilués dans le tampon de pulsation.
Préparation des tampons de pulsation des GUVs
Différents tampons de pulsation ont été utilisés lors de cette étude. Tous sont ajustés au pH 7,35 et préparés à l’aide d’eau Milli-Q.
Tampon utilisé lors des expériences de diminution de taille effectuées en contraste de phase :
260 mM de glucose 1 mM de NaCl
1 mM du couple KH2PO4/K2HPO4
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 343 µS/cm (λin /λex = 0,050)
Tampons utilisés lors des expériences avec le CaGr2 :
Tampons calcium
260 mM de glucose 1 mM de NaCl 1 mM d’Hepes
100 µM de CaCl2 / 1 mM de CaCl2 /2, 5 mM de CaCl2
Les conductivités électriques de ces tampons sont respectivement :
Tampon EDTA
260 mM de glucose 1 mM de NaCl 1 mM d’Hepes 100 µM d’EDTA
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 346 µS/cm (λin /λex = 0,049)
Tampon manganèse Osm = 268 mOsm/L
260 mM de glucose 1 mM de NaCl 1 mM d’Hepes 2 mM de MnCl2
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 475 µS/cm (λin /λex = 0,036)
Tampons pour la déformation des vésicules
Tampon hyperosmotique sans NaCl Osm = 262 mOsm/L
260 mM de glucose 1 mM d’Hepes
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 85 µS/cm (λin /λex = 0,201)
Tampon hyperosmotique avec 1 mM NaCl Osm = 260,3 mOsm/L
258,3 mM de glucose 1 mM d’Hepes 1 mM de NaCl
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 257 µS/cm (λin /λex = 0,067)
Tampon hyperosmotique avec 5 mM NaCl Osm = 261,7 mOsm/L
251,7 mM de glucose 1 mM d’Hepes 5 mM de NaCl
Tampon isoosmotique sans NaCl Osm = 240 mOsm/L 240 mM de glucose
1 mM d’Hepes
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 88 µS/cm (λin /λex = 0,194)
Tampon isoosmotique avec 1 mM NaCl Osm = 240 mOsm/L
238,4 mM de glucose 1 mM d’Hepes 1 mM de NaCl
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 237 µS/cm (λin /λex = 0,072)
Tampon isoosmotique avec 5 mM NaCl Osm = 240 mOsm/L
231,7 mM de glucose 1 mM d’Hepes 5 mM de NaCl
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 512 µS/cm (λin /λex = 0,033)
Tampon hypoosmotique sans NaCl Osm = 230 mOsm/L
230 mM de glucose 1 mM d’Hepes
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 104 µS/cm (λin /λex = 0,164)
Tampon hypoosmotique avec 1 mM NaCl Osm = 230,3 mOsm/L
228,3 mM de glucose 1 mM d’Hepes 1 mM de NaCl
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 203 µS/cm (λin /λex = 0,084)
Tampon hypoosmotique avec 5 mM NaCl Osm = 231,7 mOsm/L
221,7 mM de glucose 1 mM d’Hepes 5 mM de NaCl
Tampon pour la fusion et les interactions avec les TriCat
260 mM de glucose 1 mM de NaCl 1 mM d’Hepes
La conductivité électrique de ce tampon est : λex = 260 µS/cm (λin /λex = 0,066)
Observation des GUVs
Pour observer les GUVs, est introduit, dans la chambre d’observation, 50 µL de tampon de pulsation et 0,5 µL de solution contenant les GUVs formées préalablement. Avant toute observation, on laisse les GUVs se stabiliser dans la chambre pendant dix minutes.
Les GUVs sont observés sous microscope inversé Leica DM IRB® à l’aide d’un objectif à contraste de phase x40, PHACO 2 et à air. La source est une lampe halogène. Ce microscope possède un dispositif d’anneaux de phase permettant des observations en contraste de phase, les indices extérieurs et intérieurs des GUVs étant différents du fait des tampons utilisés. Une lampe à mercure est utilisée pour illuminer les échantillons fluorescents. Les échantillons sont observés grâce à un miroir dichroïque à une excitation de 488 nm pour exciter le CaGr2 et 550 nm pour exciter la lissamine rhodamine B ou bien par contraste de phase grâce à une lampe halogène. Ce microscope possède un cube dichroïque permettant d’illuminer les échantillons sous différentes longueurs d’onde. Les images sont acquises avec un temps d’exposition de 25 ms (excepté pour les expériences de déformations pour lesquelles le temps d’exposition est de 10 µs).
Les acquisitions sont effectuées via une caméra CCD rapide Quantem 512SC® reliée à un ordinateur. Le logiciel d’acquisition utilisé est Métavue®. Les images sont prises avec un temps d’exposition de 25 ms.
Pulsation des GUVs
Un champ électrique est appliqué dans la chambre entre les deux électrodes par l’intermédiaire d’un générateur haute tension βtech® unipolaire. On applique toujours 10 impulsions de 100 µs ou 5 ms à une fréquence de 1 Hz et d’amplitudes variables.
Comme indiqué dans les spécifications du constructeur, la tension affichée par le générateur ne correspond pas à la tension réelle délivrée entre 1 et 100V. Une courbe de correspondance entre la tension demandée au générateur (affichée sur le générateur) et la tension effectivement délivrée a été effectuée (Figure 73). Les champs électriques déterminés dans toutes les expériences tiennent compte de la tension réelle et non de la tension affichée par le générateur.
Figure 73 : Caractéristique de la correspondance entre la tension affichée sur le générateur et la tension effectivement délivrée par le générateur. Pour toutes les études faisant intervenir un champ électrique, la tension réelle est prise en compte.
L’observation des effets de la pulsation sur les GUVs est effectuée en prenant une image du GUV avant pulsation puis quelques secondes après pulsation. Dans le cas des images de fluorescence, la différence entre ces deux images prises avant et après impulsions permet de visualiser l’effet du champ électrique en termes de perméabilisation de la membrane, en fournissant une visualisation quantitative des termes d’échange induits.
Traitement des images acquises
Une image avant toute impulsion est acquise et toutes les autres images sont traitées en fonction de cette première acquisition.
Dans un premier temps on effectue une différence entre les images pour identifier des modifications d’intensité. L’image avant impulsion est soustraite à celle après impulsion lorsqu’on veut identifier une augmentation d’intensité de fluorescence et le calcul inverse est effectué pour visualiser une diminution d’intensité de fluorescence. Les soustractions sont effectuées à l’aide du logiciel Métavue® et à la soustraction des images, le logiciel ajoute le
0 25 50 75 100 125 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Tension affichée par le générateur (V)
T e n s io n r é e ll e ( V )
chiffre 1. Cette approche nous affranchit des problèmes de décalages dus à l’électronique et au bruit noir.
Ces différences d’images sont ensuite traitées avec le logiciel ImageJ® avec lequel on applique un filtre médian à 4 pixels sur chacune des images soustraites, les profils d’intensité (Analyze Plot Profile) de chaque GUV sont tracés. La valeur de l’intensité considérée dans les graphes présentés ici est la moyenne des valeurs du palier central observé sur les profils (Figure 74).
Figure 74 : Principe du traitement d’image. L’image de gauche est la soustraction des images prises avant l’impulsion électrique et après une impulsion électrique de 10 V/cm. Un filtre médian à 4 pixels lui a été appliqué. Le profil d’intensité présenté à droite est tracé le long du trait bleu présent sur l’image. La moyenne du plateau, représentée par le trait rouge, représente la valeur d’intensité prise en compte prise en compte pour tracer les graphes des intensités en fonction de la valeur du champ électrique appliqué au GUV.
Observation des déformations des GUVs
Pour visualiser les déformations des GUVs, il est nécessaire d’observer la vésicule juste à la fin de l’impulsion électrique. Une image des 10 dernières µs de l’impulsion de 100 µs est prise. Le microscope inversé Leica DM IRB® équipé de l’objectif à air x40 a été utilisé. Sur ce microscope a été monté une LED verte Luxeon® d’une puissance de 3 W en transmission. Entre cette LED et l’objectif est placée une lentille convergente de distance focale 2 cm pour focaliser le faisceau lumineux dans l’objectif. Les images sont prises en contraste de phase. La LED est branchée à un générateur TTI TGP110® qui génère des impulsions DC et est déclenché avec un délai de 90 µs après le début de l’impulsion électrique. Ce générateur TTI TGP110® et la caméra EMCCD Quantem 512SC® montée sur le microscope sont synchronisés par le générateur d’impulsions unipolaire à haute tension βtech®. En conséquence, on ne prend une image de la vésicule que durant les dix dernières µs de l’impulsion électrique (Figure 75).
Ce montage a été réalisé avec l’aide de M.C. Blache et F. Bissières sur les « conseils » de J. Teissié.
Figure 75 : Schéma électrique et photos du dispositif de prise d’images de durée 10 µs déclenchées à un moment donné.
Les images sont acquises via le logiciel Métavue®. Les profils d’intensité le long des vésicules sont ensuite tracés. La membrane est détectée par un pic d’intensité (Figure 76). L’excentricité de chaque vésicule est ensuite calculée en faisant le rapport de sa taille prise perpendiculairement au champ électrique par sa taille prise parallèlement au champ électrique.
Figure 76 : Principe du traitement d’image pour visualiser des déformations. L’image de gauche est l’image prise grâce à la méthode décrite ci-dessus. Le profil d’intensité présenté à droite est tracé le long du trait bleu présent sur l’image. Le diamètre du GUV est mesuré entre les deux pics d’intensité caractéristiques de la membrane, représentés par les traits rouges.