Préparation de la suspension de Candida albicans

1.1.

Origine et conservation de C. albicans

La souche de levure choisie pour cette étude est C. albicans IP48.72 (Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France). Elle est conservée à -80 °C dans une solution de cryoconservation. Avant réalisation des essais, la souche est remise en culture sur gélose de Sabouraud (BioMérieux, Crapone, France), incubée à 30 °C pendant 48 h.

1.2

Préparation des suspensions de travail

Les suspensions d’essai sont réalisées à partir d’aliquots congelés provenant des deuxièmes et troisièmes repiquages de C. albicans IP48.72 sur gélose de Sabouraud. Une culture est réalisée dans du milieu liquide de Sabouraud (Sabouraud Dextrose liquid Medium, OXOID, CM0147) (30 g/L, ph=5.6 à 23°C). Après 72 h d’incubation à 30 °C sans agitation (phase stationnaire de croissance) (après 4h dans le cas des essais à différentes températures d’incubation), les cellules sont récupérées après filtration à l’aide d’un filtre membrane à porosité nominale de 10 µm (Dutscher, filtre isopore). Cette filtration permet de maximiser la récupération de cellules uniques en éliminant les agrégats et les cellules sous forme d’hyphes. Après vérification de l’absence de contamination par observation au microscope optique (x 400), les cellules sont collectées par centrifugation pendant 3 min à 13000 rpm à température ambiante, lavées deux fois puis remises en suspension dans de l’EPPI. Pour les essais, la suspension cellulaire est diluée pour atteindre une DO600nm correspondant à 1.5 soit environ

1.107 UFC/mL. Un contrôle des UFC/mL est réalisé par dilutions de raison 10 de la suspension et inclusion de 1 mL de chaque dilution en gélose de Sabouraud (incubation 72h à 30°C).

104

1.3

Préparation des suspensions microbiennes pour les analyses de viabilité

cellulaire

➢ Contrôle de l’influence de l’EPPI et des marqueurs fluorescents sur la viabilité cellulaire Sachant que les levures restent en conditions statiques durant 1h30 dans la chambre à écoulement cisaillé, nous avons voulu connaitre l’influence de l’EPPI et des marqueurs fluorescents sur la viabilité des levures. Pour connaitre l’influence de l’EPPI sur la suspension microbienne, 3 mL d’une suspension de levures dans de l’EPPI (DO600nm correspondant à 1.5

soit environ 1.107 _{UFC/mL) sont placés en condition statique durant 1h30. Après ce temps}

d’attente, 9 µl de chacun des marqueurs fluorescents ont été ajoutés à la suspension microbienne. Le principe du kit de fluorescence (ThermoFisher Scientific) utilisé est basé sur une double coloration par l'intermédiaire de deux fluorophores : le SYTO9® et l’Iodure de Propidium (IP). Le SYTO9® est un fluorophore qui, après excitation à 470 nm, émet une fluorescence de couleur verte à 540 nm. Ce marqueur possède la capacité de diffuser dans les cellules, intègres ou non, et d'émettre de la fluorescence une fois liée à l'ADN. Le SYTO9® permet donc de marquer la totalité des levures de l’échantillon. L’IP est un agent intercalant de l'ADN, une fois lié à ce dernier, il émet une fluorescence rouge (635 nm) après excitation à 470 nm. Ce fluorophore ne peut pénétrer que dans les cellules dont les membranes sont altérées, induisant alors une fluorescence rouge. Le dénombrement des levures viables et non viables a été effectué ensuite à l’aide du microscope confocal ZEISS Axiotech 100HD et du logiciel Zen 2.5 /Zen 2.3.1 carl Zeiss microscopy GmbH couplé avec le microscope. Le comptage des levures a ensuite été effectué à l’aide du logiciel ImageJ. Pour connaitre l’influence des marqueurs fluorescents sur la viabilité des levures, 9 µl de chacun des marqueurs fluorescents (Syto9® _{et IP) ont été ajoutés à dans la suspension microbienne (DO}

600nm

correspondant à 1.5 soit environ 1.107 _{UFC/mL). Les levures sont ensuite restées en condition}

statique durant 1h30 avec les marqueurs fluorescents. Après ce temps d’attente, le dénombrement des levures est effectué comme indiqué précédemment.

➢ Expériences de viabilités cellulaires avec les différents nanocomposites

Lors des analyses de viabilité des levures en présence de nos différents substrats nanocomposites, 9 µl de chacun des marqueurs fluorescents ont été ajoutés à la suspension microbienne (préparé section 1.2, DO600nm correspondant à 1.5 soit environ 1.107 UFC/mL).

Les levures ont ensuite été injectées dans la chambre à écoulement cisaillé et une photographie de la fluorescence émise par les levures a été effectuée. Les levures sont restées ensuite en

105

condition statique durant 1h30 dans la chambre en présence des différents substrats nanocomposites. Après ce temps d’attente, une autre photographie de la fluorescence émise par les levures a été effectuée. Comme indiqué précédemment, le dénombrement des levures viables et non viables a été effectué avec ImageJ.

2. Préparation des différentes solutions protéiques :

2.1

Protéine Discosoma Rouge Fluorescente (DsRed)

La DsRed (Biovision) est sous forme lyophilisée et présente une pureté de 97 %. Une solution mère de 1 g/L a été préparée dans de l’EPPI. La valeur de pH de la solution mère de DsRed était de 6.6. La stabilité du pH de la solution mère a été contrôlée pour toutes les mesures. Les mesures ont été effectuées à température ambiante (23 °C± 2 °C). La solution mère de DsRed a ensuite été diluée de 4 à 20 fois dans de l’EPPI pour l’étude de la caractérisation des gouttelettes.

2.2

Sérum Albumine Bovine (SAB)

La SAB (Sigma-Aldrich) est sous forme de cristaux déshydratés. Une solution mère de 5 g/L a été préparée dans l’EPPI. La valeur de pH de la solution mère de SAB est de 5.6, tandis que le point isoélectrique (pI) de la SAB est de 4.7 dans l'eau à 25 °C. La stabilité du pH des solutions a été contrôlée durant toutes les mesures. Les essais avec la SAB ont été réalisés à température ambiante (23°C± 2 °C). La solution mère de SAB a ensuite été diluée de 5 à 100 fois avec de l’EPPI pour l’étude de la caractérisation des gouttelettes.

2.3

Fibronectine plasmatique humaine (Fn)

La Fn (Sigma-Aldrich) est sous forme lyophilisée. Une solution mère de 1 g/L a été préparée dans de l’EPPI. La solution mère de Fn a été diluée 2 à 100 fois dans de l’EPPI. Le pH de la solution mère de Fn a été mesuré à 7.5.

2.4

Création des gammes de pH des solutions protéiques

Une gamme de solution de DsRed et de SAB possédant des valeurs de pH de 3 à 11 a été préparée. La concentration protéique de la gamme a été fixée à 0.05 g/L. Les valeurs de pH de 3 et 5 ont été obtenues avec une solution tampon citrate-phosphate (0.5 M). Les valeurs de pH de 9 et 11 ont été obtenues avec une solution tampon bicarbonate de sodium/hydroxyde de

106

sodium (NaHCO3/NaOH) à 0.05 M et 0.1 M respectivement. Les valeurs de pH de 3 et 5 ont

été ajustées en ajoutant un volume prédéterminé d’acide citrique à 0.5 M. Les valeurs de pH de 9 et 11 ont été ajustées en ajoutant un volume prédéterminé de NaOH à 0.1 M.