Préparation de l’ADNg

Dans un premier temps, les extractions d’ADNg ont été réalisées, pour 21 souches de

Vibrio, à l’aide du kit DNeasy® Blood & Tissue de Qiagen. L’intégrité des extraits ainsi obtenus

a été vérifiée par migration sur gel d’agarose 1% et leur pureté a été évaluée à l’aide du spectrophotomètre NanoVue™ (Tableau I-2). A l’exception de l’extrait d’ADNg issu de la souche V. crassostreae pour lequel un ratio A260/A280 de 1,9 est mesuré, tous les autres échantillons présentent un ratio supérieur ou égal à 2,1. Or, pour des extraits d’ADN provenant de suspensions pures, ce ratio devrait être compris entre 1,8 et 2,0 pour de l’ADN et entre 2,0 et 2,2 pour de l’ARN. Ainsi, les résultats obtenus semblent indiquer une

89 contamination des extraits d’ADNg par de l’ARN. Afin de renforcer cette hypothèse, l’ensemble des échantillons a ensuite été analysé à l’aide d’un second système de mesure spectrophotométrique, le NanoDrop™ basé sur le même principe de fonctionnement que le NanoVue™. Les ratios A260/A280 observés sont similaires à ceux mesurés à l’aide du NanoVue™ et sont au minimum de 2,1, confirmant ainsi les résultats précédemment obtenus.

Les spectrophomètres NanoVue™ et NanoDrop™ permettent non seulement d’estimer la pureté des extraits d’acides nucléiques mais aussi de les quantifier par mesure de l’absorbance à 260 nm (Tableau I-3). Cependant, à cette longueur d’onde, les contaminants et les acides nucléiques dégradés sont également détectés, entrainant une surestimation de la concentration réelle en acides nucléiques intacts dans l’échantillon. Par conséquent, afin de quantifier seulement l’ADN intact et de déterminer dans quelle mesure les résultats obtenus

Souche Référence ^{Ratio A260/A280} NanoVue™Plus

Ratio A260/A280 NanoDrop™1000

V. aestuarianus aestuarianus ATCC 35048 _{2,2 2,2}

V. alginolyticus ATCC 17749 _{2,2 2,1} V. campbellii ATCC 25920 _{2,2 2,2} V. cincinnatiensis CIP 104173 _{2,2 2,1} V. coralliilyticus CIP 107925 _{2,1 2,1} V. crassostreae CIP 108327 _{1,9 2,1} V. fortis CIP 108196 _{2,2 2,2} V. gigantis CIP 108656 _{2,3 2,1} V. halioticoli CIP 106283 _{2,2 2,1} V. harveyi ATCC 14126 _{2,2 2,1} V. lentus CIP 107166 _{2,1 2,1} V. litoralis CIP 109585 _{2,3 2,2} V. mediterranei ATCC 43341 _{2,2 2,1} V. metschnikovii CIP 69.14 _{2,2 2,1} V. natriegens ATCC 14048 _{2,2 2,1} V. neptunius CIP 108274 _{2,2 2,1} V. rumoiensis CIP 109752 _{2,3 2,2} V. splendidus ATCC 33125 _{2,3 2,2} V. splendidus CIP 107716 2,3 _2,1 V. tapetis CIP 104856 2,3 _2,2 V. tasmaniensis CIP 108272 _{2,2 2,1}

Tableau I-2 : Ratio A260/280 mesuré à l’aide des spectrophotomètres NanoVue™ Plus et

NanoDrop™ 1000 pour des échantillons d’ADN extraits à partir de 21 souches de Vibrio avec le kit DNeasy® Blood & Tissue.

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avec des techniques spectrophotométriques divergent de ceux issus d’un dosage direct, un dosage au PicoGreen®, basé sur l’intercalation d’une molécule fluorescente au sein de la double hélice d’ADN a ensuite été envisagé. De manière générale, des concentrations en ADN en moyenne 10 à 40 fois plus faibles que celles mesurées avec le NanoVue™ et le NanoDrop™ sont obtenues, mettant ainsi en évidence les biais inhérents aux méthodes spectrophotométriques et confortant l’hypothèse de l’impureté des extraits d’ADN obtenus avec le kit DNeasy® Blood & Tissue.

Afin de confirmer la présence potentielle d’ARN dans les extraits obtenus avec le kit DNeasy® Blood & Tissue, ces mêmes échantillons ont ensuite été analysés à l’aide du kit ARN du Bioanalyseur (Agilent RNA 6000 Nano kit). De l’ARN a effectivement été détecté en quantité importante, avec une concentration moyenne de 435,0 ng.µL-1 mesurée sur l’ensemble des 21 extraits. De plus, les résultats obtenus apparaissent très aléatoires d’un échantillon à l’autre avec des concentrations variant entre 16 et 1332 ng.µL-1 d’ARN. La valeur moyenne du RIN de 2,6 ± 0,1 permet de conclure à une importante dégradation des ARNs

Souche Référence ^{Concentration ADN} NanoVue™Plus (ng.µL-1)

Concentration ADN NanoDrop™1000 (ng.µL-1)

Concentration ADN PicoGreen® (ng.µL-1)

V. aestuarianus aestuarianus ATCC 35048 _{350,0 346,6 39,3}

V. alginolyticus ATCC 17749 _{1022,0 962,7 108,9} V. campbellii ATCC 25920 _{336,0 355,8 23,4} V. cincinnatiensis CIP 104173 _{928,5 994,6 39,6} V. coralliilyticus CIP 107925 _{654,0 773,8 41,9} V. crassostreae CIP 108327 _{529,0 732,6 58,4} V. fortis CIP 108196 _{169,5 200,1 37,7} V. gigantis CIP 108656 500,5 535,5 16,9 V. halioticoli CIP 106283 _{417,5 419,8 25,4} V. harveyi ATCC 14126 _{300,5 311,2 52,7} V. lentus CIP 107166 _{133,5 142,5 27,9} V. litoralis CIP 109585 _{1566,0 2170,5 49,1} V. mediterranei ATCC 43341 _{318,0 340,2 21,2} V. metschnikovii CIP 69.14 _{451,5 457,2 39,3} V. natriegens ATCC 14048 _{464,5 502,4 76,7} V. neptunius CIP 108274 _{785,5 752,7 44,5} V. rumoiensis CIP 109752 _{1230,0 1287,1 10,5} V. splendidus ATCC 33125 807,0 _{766,4 7,1} V. splendidus CIP 107716 1140,0 _{1091,6 55,9} V. tapetis CIP 104856 _{350,0 374,7 25,5} V. tasmaniensis CIP 108272 _{146,5 164,0 25,5}

Tableau I-3 : Concentrations en ADN déterminées à l’aide des spectrophotomètres NanoVue™ Plus et NanoDrop™ 1000 ainsi

91 présents dans les extraits. Cette dégradation est visualisée sur les profils électrophorétiques générés par le Bioanalyseur au niveau desquels une migration des échantillons sous forme de trainées est constatée (Figure I-3).

Figure I-3 : Exemple de profils électrophorétiques obtenus à l’aide du Bioanalyseur pour des échantillons d’ADN extraits avec

le kit DNeasy® Blood & Tissue. La ligne verte représente l’indicateur de migration (marqueur interne RNA 6000 Nano Marker) intégré à l’ensemble des échantillons analysés. La piste notée M correspond au marqueur de poids moléculaire RNA 6000 Nano Ladder fourni dans le kit d’analyse RNA 6000 Nano du Bioanalyseur. Les autres pistes correspondent aux extraits d’ADN obtenus à partir des souches (1) V. alginolyticus ; (2) V. campbellii ; (3) V. cincinnatiensis ; (4) V. coralliilyticus ; (5) V.

crassostreae CIP 108327 ; (6) V. fortis ; (7) V. gigantis ; (8) V. harveyi ; (9) V. lentus ; (10) V. litoralis ; (11) V. mediterranei et

(12) V. aestuarianus aestuarianus ; (13) V. halioticoli ; (14) V. metschnikovii ; (15) V. natriegens ; (16) V. neptunius ; (17) V.

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En conclusion, les extraits obtenus à l’aide du kit DNeasy® Blood & Tissue, contaminés par de l’ARN, peuvent convenir pour une application en qPCR au cours de laquelle seul l’ADN est amplifié, mais ne conviennent pas à une analyse en génocapteurs où une distinction entre les cibles ADN et ARN doit être réalisée. Ainsi, 2 autres méthodes d’extraction de l’ADNg, à savoir les kits PowerLyzer® UltraClean® Microbial DNA Isolation et Wizard® Genomic DNA Purification ont été envisagées.

Dans un premier temps, 5 souches V. aestuarianus francesis, V. gigantis, V. mediterranei,

V. pomeroyi et V. tasmaniensis (CIP 108272) ont été sélectionnées. Pour une souche donnée,

les extractions ont été réalisées à partir d’une même suspension avec les deux kits. La migration sur gel d’agarose 1% des extraits obtenus montre que ces deux kits conduisent à l’obtention d’ADNg à la fois intacts et purs (Figure I-4). En effet, seules des bandes correspondant à de l’ADNg sont observées, aucune migration sous forme de trainée, caractéristique d’un ADN dégradé ou de la présence d’ARN dégradé n’est constatée. Pour le kit PowerLyzer® UltraClean® Microbial DNA Isolation, la très faible intensité des bandes laisse supposer des concentrations en ADNg peu élevées.

Ces observations ont par la suite été confirmées par dosage des extraits d’ADNg au PicoGreen® (Tableau I-4). Pour une souche donnée, les extraits obtenus avec le kit Wizard® Genomic DNA Purification présentent des concentrations 2 à 14 fois plus élevées que

Figure I-4 : Migration sur gel d’agarose 1% d’extraits d’ADN obtenus avec (A) le kit PowerLyzer® UltraClean® Microbial DNA

Isolation, et (B) le kit Wizard® Genomic DNA Purification. Les pistes M correspondent au marqueur de poids moléculaire Quick Load DNA Ladder (New England Biolabs, 500 pb - 10 kb). Les autres pistes correspondent aux extraits d’ADN (5 µL) issus des souches (1) V. gigantis ; (2) V. tasmaniensis CIP 108272 ; (3) V. pomeroyi ; (4) V. mediterranei ; (5) V. aestuarianus

93 ceux issus du kit PowerLyzer® UltraClean® Microbial DNA Isolation. Le temps d’extraction et le coût de revient estimés par échantillon étant équivalents pour ces deux techniques, le kit Wizard® Genomic DNA Purification apparaît comme le plus adapté pour l’extraction de l’ADNg à partir de suspensions de Vibrio pures et sera retenu comme méthode d’extraction des ADNg analysés en génocapteurs dans le chapitre III.