Prélèvements biologiques anciens

Lors de ce travail de thèse, 69 échantillons (Tableau 1) provenant de différents sites couvrant une région allant de la Khakassie (sud de la Sibérie) au sud de l’Altaï mongol ont été testés (Figure 7). Ces échantillons sont majoritairement datés de l’âge du Bronze. Ils ont été exhumés, pour la plupart d’entre eux, de kourganes (Figure 8). A l’exception de l’individu TA4 du site de Tsagaan Asga pour lequel nous disposions d’un fragment d’os long, tous les prélèvements biologiques mis à notre disposition étaient des dents.

Figure 7 : Localisation des sites pour lesquels des échantillons ont été

analysés

La correspondance pour chaque numéro est indiquée dans le tableau ci-après.

43

Localisation N° Carte Culture Datation Code labo N Nom échantillon informations complémentaires Kh19 Itkol'II, kourgane 24, tombe 1 Kh20 Itkol'II, kourgane 23, tombe 2 Kh21 Itkol'II, kourgane 27, tombe 1 Kh22 Itkol'II, kourgane 27, tombe 1

Kh1 Krasny Kamen, kourgane 1, tombe 1 Kh2 Krasny Kamen, kourgane 1, tombe 3 Kh3 Krasny Kamen, kourgane 1, tombe 6 Kh4 Uybat-Charkov, kourgane 1, tombe 1 Kh5 Uybat-Charkov, kourgane 1, tombe 2 Kh6 Uybat-Charkov, kourgane 1, tombe 3 Kh7 Uybat-Charkov, kourgane 1, tombe 3 Kh8 Uybat-Charkov, kourgane 1, tombe 6 Kh9 Uybat-Charkov, kourgane 1, tombe 9 Kh10 Uybat-Charkov, kourgane 1, tombe 11 Kh11 Uybat-Charkov, kourgane 1, tombe 11 Kh12 Uybat-Charkov, kourgane 1, tombe 12 Kh13 Itkol'II, kourgane 14, tombe 2 Kh14 Itkol'II, kourgane 14, tombe 3 Kh15 Itkol'II, kourgane 14, tombe 5 Kh16 Itkol'II, kourgane 14, tombe 7 Kh17 Itkol'II, kourgane 14, tombe 8 Kh18 Itkol'II, kourgane 14, tombe 9 6 Teleytskiy Vzvoz-I, tombe 7 7 Teleytskiy Vzvoz-I, tombe 18 8 Teleytskiy Vzvoz-I, tombe 21 9 Teleytskiy Vzvoz-I, tombe 41 10 Staroaleyka-2, tombe 64 Bol'shemysskaya Enéolithique Bol 1 11 Tytkesken-VI, kourgane 61

1 Bersyukta-I, kourgane 1

Localisation N° Carte Culture Datation Code labo N Nom échantillon informations complémentaires AT_626 Kulala ula, kourgane AT_628 Kumdi goovi, kourgane, tombe 2 AT_635 Kurgak govi 2, kourgane, tombe 2

TA4 Tsagaan Asga, tombe 4 TU18 Takhilgat Uzuur-5, tombe 18, enfant TU25 Takhilgat Uzuur-5, tombe 25 TU32 Takhilgat Uzuur-5, tombe 32 TU34 Takhilgat Uzuur-5, tombe 34 Afanasievo 2742 ± 92

avant J.-C Maf 1 TU31 Takhilgat Uzuur-5, tombe 31

12 Ulaan Hudag-I, kourgane 12 13 Ulaan Hudag-II, kourgane 3 14 Ulaan Hudag-I, kourgane 12 15 Halzan Uzuur-II, kourgane 2 16 Halzan Uzuur-II, kourgane 4 Khovd aimag, Mongolie 8 Munkh-Khairkhan 1700-1400

avant J.-C MK 1 AT_614 Ulaan goviin uzuur 2, kourgane AT_861 Khukh khushoony bom 1, kourgane AT_862 Khukh khushoony bom 2, kourgane AT_592 (1,2,3,4,5) Yagshiin khodoo, kourgane 3

AT_642 Keviin am, kourgane 2 AT_640 Buural kharyn ar, kourgane ATNEW01 kheviin am, kourgane 1

AT_630 Kheviin am, kourgane 1, tombe 3 AT_672 Uliastain gol III, kourgane 7 AT_681 Uliastain gol III, kourgane 2

nombre d'échantillons testés 69

Nord de l'Altaï, Mongolie Chemurchek 2500-2300 avant J.-C

Zabkhan aimag, Mongolie Munkh-Khairkhan 1700-1400

avant J.-C MK 2

Figure 8 : Tombe de l’individu TA10 du site de Tsagaan Asga

La répartition chronologique et géographique des 69 échantillons testés est présentée dans la Figure 9. Suivant une distribution spatiale, le groupe étudié se décompose de la façon suivante : 22 échantillons proviennent de la Khakassie, 11 de l’Altaï russe et 36 de Mongolie.

Selon une distribution chronologique, 11 individus sont datés du début de l’âge du bronze ou avant, 39 sont datés du mileu de l’âge du Bronze (env. 2000 ans avant J.-C) et enfin 19 individus sont attribués à des cultures datant de la fin de l’âge du Bronze.

Figure 9 : Répartition chronologique et géographique des prélèvements analysés

Photo E. Crubézy

46

II.1.1 Traitement des échantillons

Les dents et les os sont généralement les seuls restes disponibles pour retrouver de l’ADN.

Nous avons choisi de travailler principalement à partir de prélèvements dentaires car ils présentent plusieurs avantages : (i) les dents ne sont pas totalement résistantes aux contaminations mais l’émail dentaire, du fait de sa faible porosité, est une bonne barrière protectrice contre d’éventuelles dégradations (UV, moisissures, microbes…), (ii) les prélèvements sont relativement faciles à décontaminer, et (iii) chaque dent peut être traitée de façon indépendante facilitant la réplication des analyses. Lorsque plusieurs prélèvements sont à notre disposition par individu, une observation macroscopique nous permet dans un premier temps de choisir le prélèvement qui paraît le mieux préservé. Pour les prélèvements dentaires par exemple, le choix se portera dans l’idéal, sur une dent non cariée, sans fissure et avec des racines fermées afin de limiter l’entrée de contaminants.

II.1.1.1 Préparation des échantillons

La première étape du traitement des échantillons consiste en une décontamination de surface.

Cette étape est très importante surtout lorsque les conditions dans lesquelles ont été prélevés et stockés les échantillons ne sont pas connues.

Les prélèvements dentaires sont dans un premier temps débarrassés des éventuels résidus de terre à l’aide d’un scalpel stérile. Puis ils sont ensuite nettoyés à l’aide de compresses stériles légèrement imbibées d’eau de javel à 30% puis rincés avec de l’eau ultrapure et enfin exposés aux UV sur chaque face pendant 20 min. Cette étape est très délicate, la dent ne doit pas être trop imbibée car bien que l’émail procure une barrière protectrice, les prélèvements étant anciens, la dent s’est fragilisée. Il est possible que des fissures se soient formées ou que les racines ne soient pas totalement fermées, notamment chez les immatures, entrainant l’infiltration de contaminants ou des solutions de lavage pouvant ainsi léser l’ADN. Une fois nettoyée, la dent est prête à être réduite en poudre.

Pour les prélèvements osseux, la méthode est différente. Les contaminants pouvant s’infiltrer plus profondément dans l’os, jusqu’au moins 1 à 2 millimètres d’épaisseur (Bouwman et al., 2006), il ne suffit pas uniquement de nettoyer sa surface mais d’en enlever une partie. Pour cela, à l’aide d’une dremel, l’os ou le fragment osseux est abrasé mécaniquement sur toute sa surface sur quelques millimètres de profondeur. Cette étape est réalisée sous une hotte à

47

extraction dédiée à cet effet. La partie ainsi nettoyée est ensuite utilisée pour être réduite en poudre.

Afin d’être réduits en poudre, les prélèvements décontaminés sont placés dans un cryobroyeur à azote liquide (6870 FREEZER/MILL^®, SPEX Sample Prep^®). Le froid permet d’éviter les échauffements qui peuvent induire une dégradation des molécules d’ADN durant cette étape.

Les prélèvements sont ensuite stockés dans une salle dédiée aux échantillons anciens à l’abri de la lumière et dans des conditions stables de température. Ainsi, il est possible de collecter à partir d’une dent, de quelques centaines de milligrammes de poudre (dent d’immature), à 2 grammes (molaire d’adulte). A partir d’un prélèvement osseux, la quantité récupérée est souvent plus importante, de l’ordre de plusieurs grammes.

II.1.1.2 Extraction de l’ADN